Microdissection de l’œil de rongeur
Summary
Cet article présente un protocole pour la microdissection oculaire chez les rongeurs. Le processus implique l’énucléation du globe oculaire avec la membrane nictitante (c’est-à-dire la troisième paupière). Ceci est ensuite suivi par la séparation des cupules postérieures et antérieures.
Abstract
La micro-dissection oculaire de l’œil de rongeur implique la segmentation du globe oculaire énucléé avec la membrane nictitante attachée, ou troisième paupière, pour obtenir les oculaires antérieur et postérieur. Avec cette technique, les sous-parties de l’œil, y compris le tissu cornéen, le tissu neural, le tissu épithélial pigmentaire rétinien (EPR) et le cristallin, peuvent être obtenues pour des montages entiers, une cryosection et / ou des suspensions unicellulaires d’un tissu oculaire spécifique. La présence de la troisième paupière présente des avantages uniques et significatifs, car elle favorise le maintien de l’orientation de l’œil, ce qui est important pour comprendre la physiologie oculaire à la suite de toute intervention localisée ou dans les études impliquant une analyse oculaire relative à la topographie spatiale de l’œil.
Dans cette méthode, nous avons énucléé le globe oculaire à l’orbite avec la troisième paupière en coupant soigneusement et lentement les muscles extraoculaires et en sectionnant le nerf optique. Le globe oculaire a été percé à travers le limbe cornéen à l’aide d’une microlame. L’incision a été utilisée comme point d’entrée, permettant de couper le long de la jonction cornéenne-sclérale en insérant des micro-ciseaux à travers le point d’incision. De petites coupes continues le long de la circonférence ont été faites jusqu’à ce que les tasses se séparent. Ceux-ci pourraient être disséqués davantage en décollant doucement la couche translucide de la rétine neurale à l’aide de pinces de suture Colibri pour obtenir la rétine neurale et les couches RPE. De plus, trois/quatre coupes équidistantes ont été faites de la périphérie perpendiculairement au centre optique jusqu’à ce que le nerf optique soit atteint. Cela a ouvert les coupes hémisphériques en forme de fleuron afin qu’elles tombent à plat et puissent être facilement montées. Cette technique a été utilisée dans notre laboratoire pour les montages cornéens entiers et les coupes rétiniennes. La présence de la troisième paupière délimite l’orientation nasale-temporale, ce qui permet l’étude de diverses interventions de thérapie cellulaire post-transplantation et, par conséquent, la validation physiologique ciblée vitale pour la visualisation et la représentation précise dans de telles études.
Introduction
La dissection oculaire est une technique importante dans la recherche ophtalmique et a permis aux chercheurs d’accéder aux segments de l’œil pour des études ciblées. Auparavant, les chercheurs oculaires s’appuyaient sur le tissu oculaire d’individus malades pour leurs études. Cependant, le nombre croissant de souches de modèles ophtalmiques de rongeurs1 au fil des ans a diminué le besoin de tissu oculaire humain. Ces souches de souris ont permis une meilleure compréhension des maladies oculaires et des interventions. Pourtant, ils ont également généré un besoin de techniques innovantes de micro-dissection oculaire. La petite taille et la zone d’exploitation limitée limitent considérablement l’accès effectif aux sous-parties oculaires. De plus, en raison de l’assemblage cellulaire homogène des oculaires postérieur et antérieur, il est difficile de mener des interventions ciblées après la dissection. Les techniques actuelles de microdissection du laser2 et de la microdissection chirurgicale 3,4 sont insuffisantes pour répondre à ces exigences de la recherche oculaire. La micro-dissection au laser est très efficace dans l’analyse unicellulaire, mais le tissu spécifique doit être micro-disséqué avant la procédure au laser2. La technique permet d’isoler de petites régions d’intérêt à partir d’un tissu pré-disséqué pour une analyse moléculaire. Ainsi, la technique n’est pas adaptée à la préparation de montages entiers ou à l’isolement de couches oculaires emballées axialement pour une visualisation optimale.
La méthode chirurgicale est la technique la plus utilisée; Cette méthode consiste à immobiliser l’œil via le nerf optique5 puis à effectuer la dissection. Cette pratique est ardue et peut endommager tout tissu fragile, car l’œil sphérique continue de bouger pendant la dissection. Bien qu’elle soit bénéfique pour isoler les différentes sections des couches rétiniennes, la technique ne peut pas délimiter l’orientation spatiale du tissu lors de la dissection.
Lors de la dissection, le maintien de la présence de la membrane nictitante attachée ou de la troisième paupière (Figure 1) présente des avantages uniques et significatifs. Dans cette méthode, d’abord, le globe oculaire est énucléé avec la troisième paupière. Ensuite, la troisième paupière sert à immobiliser l’œil6 (Figure 2A). Ceci est suivi en perçant le globe oculaire à travers le limbe cornéen et en utilisant l’incision comme point d’entrée (Figure 2B, C). Ensuite, les œillets sont séparés en coupant le long de la circonférence antérieurement et postérieurement (Figure 2D-G). En disséquant davantage l’œilleton postérieur, la couche translucide de la rétine neurale peut être identifiée et délicatement décollée. Trois ou quatre coupes équidistantes sont ensuite réalisées dans les coupes hémisphériques antérieures et postérieures obtenues, ce qui permet à ces coupes en forme de fleurs de tomber à plat sur une lame (Figure 2H).
La troisième paupière facilite la manipulation facile et efficace pendant la dissection, assurant ainsi des dommages minimes au tissu lors de l’accès aux différentes couches oculaires et lors de la production de montures entières. De plus, la présence de la troisième paupière aide à localiser et à examiner les interventions localisées pendant la visualisation.
La procédure, dans notre laboratoire, a été effectuée sur une souche de souris CBA / J ou rd1 à P28 de n’importe quel sexe. La procédure peut être effectuée sur n’importe quelle souche, âge ou sexe de l’animal et n’a aucun biais en fonction de ces caractéristiques.
Les animaux ont été achetés auprès de sources commerciales (voir le tableau des matériaux) et conservés à l’installation pour petits animaux (SAF) de l’Institut national d’immunologie (NII). Ils ont été gardés dans des cages ventilées individuelles (IVC) et ont reçu un accès ad libitum à de l’eau autoclavée acidifiée et à de la nourriture. Ils ont été maintenus à 21-23 °C et avec un cycle lumière/obscurité de 14 h/10 h.
Vous trouverez ci-dessous une méthode chirurgicale modifiée pour la micro-dissection d’un œil de souris.
Protocol
Representative Results
Discussion
La microdissection oculaire s’est avérée être une tâche difficile en raison de la petite taille et de la forme sphérique de l’œil de rongeur, et l’œil de rongeur nécessite des techniques innovantes pour une manipulation efficace8.
Dans la méthode actuellement démontrée, le globe oculaire de souris énucléé est obtenu avec la troisième paupière attachée pour une manipulation efficace et facile. En utilisant la troisième paupière, le globe oculair…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le Dr Alaknanda Mishra, du Département de biologie cellulaire et d’anatomie humaine de l’Université de Californie à Davis, aux États-Unis, nous a formés à cette méthode à l’Institut national d’immunologie de New Delhi. Ce travail a été soutenu par la subvention de base reçue du Département de biotechnologie du gouvernement indien à l’Institut national d’immunologie de New Delhi. P.S. a reçu une bourse de recherche du Département de biotechnologie.
Materials
| Acetaminophen (Biocetamol) | EG Pharmaceuticals | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Betadine (Povidon-Iodine Solution) | Win-Medicare; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Biological safety cabinet ( Class I) | Kartos international; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| CBA/J inbred mice | The Jackson Laboratory | Stock No. 000654 | |
| Cefotaxime (Taxim) | AlKem ; India | cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Cell Strainer | Sigma ; US | CLS431752 | |
| Collagenase Type I | Gibco by Life Technologies | 17100-017 | |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd ; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| DPX Mountant | Sigma ; US | 6522 | |
| Drape Sheet | JSD Surgicals, Delhi, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma ; US | HT110132 | |
| Forceps | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Glucose | Himedia, India | GRM077 | |
| Hair removing cream (Veet) | Reckitt Benckiser , India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma ; US | MHS16 | |
| Heparin sodium salt | Himedia; India | RM554 | |
| Hyaluronidase From Sheep Testes | Sigma ; US | H6254 | |
| I.V. Cannula (Plusflon) | Mediplus, India | Ref 1732411420 | |
| Insulin Syringes | BD ; US | REF 303060 | |
| Isoflurane ( Forane) | Asecia Queenborough | No B506 | Inhalation Anaesthetic |
| Ketamine (Ketamax) | Troikaa Pharmaceuticals Ltd. | Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Meloxicam (Melonex) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Micro needle holders straight & curved | Mercian ; England | BS-13-8 | |
| Micro needle holders straight & curved |
Mercian ; England | BS-13-8 | |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Nylon Thread | Mighty ; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Refresh Tears/Eyemist Gel | Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India | P3060 | No specific Catalog Number |
| RPMI | Himedia; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scalpel | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scissors | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation ; US | No specific Catalog Number | |
| Sucrose | Sigma ; US | S0389 | |
| Surgical Blade No. 22 | La Medcare, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical Board | Locally made | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical White Tape | 3M India ; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Sutures | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| Syringes (1ml, 26 G) | Dispo Van; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Trimmer (Clipper) | Philips | NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005 | |
| Weighing Machine | Braun | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| William's E Media | Himedia; India | AT125 | |
| Xylazine (Xylaxin) | Indian Immunologicals Limited | Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant |
Referências
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- Sutherland, C., et al. Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis. J Vis Exp. (136), e57576 (2018).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).
- Claybon, A., Bishop, A. J. Dissection of a mouse eye for a whole mount of the retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (48), e2563 (2011).
- Steven, P., et al. Experimental induction and three-dimensional two-photon imaging of conjunctiva-associated lymphoid tissue. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (4), 1512-1517 (2008).
- Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo. Journal of Visualized Experiments. (77), e50546 (2013).
- Ullmann, J. F., Moore, B. A., Temple, S. E., Fernandez-Juricic, E., Collin, S. P. The retinal wholemount technique: A window to understanding the brain and behaviour. Brain, Behavior and Evolution. 79 (1), 26-44 (2012).
- Nakao, S., Hafezi-Moghadam, A., Ishibashi, T. Lymphatics and lymphangiogenesis in the eye. Journal of Ophthalmology. 2012, 783163 (2012).
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