Mikrodissektion des Nagetierauges
Summary
In diesem Artikel wird ein Protokoll für die okuläre Mikrodissektion bei Nagetieren vorgestellt. Der Prozess beinhaltet die Enukleation des Augapfels zusammen mit der Nickhaut (d.h. dem dritten Augenlid). Es folgt die Trennung der hinteren und vorderen Augenmuscheln.
Abstract
Die okuläre Mikrodissektion des Nagetierauges beinhaltet die Segmentierung des enukleierten Augapfels mit der angebrachten Nickhaut oder dem dritten Augenlid, um die vorderen und hinteren Augenmuscheln zu erhalten. Mit dieser Technik können die Teilteile des Auges, einschließlich des Hornhautgewebes, des Nervengewebes, des retinalen Pigmentepithelgewebes (RPE) und der Linse, für Ganzkörper, Kryoschnitte und/oder Einzelzellsuspensionen eines bestimmten Augengewebes erhalten werden. Das Vorhandensein des dritten Augenlids bietet einzigartige und bedeutende Vorteile, da es der Aufrechterhaltung der Ausrichtung des Auges zugute kommt, was für das Verständnis der Augenphysiologie nach einem lokalisierten Eingriff oder bei Studien mit Augenanalyse in Bezug auf die räumliche Topographie des Auges wichtig ist.
Bei dieser Methode haben wir den Augapfel an der Augenhöhle zusammen mit dem dritten Augenlid enukleiert, indem wir vorsichtig und langsam durch die extraokularen Muskeln geschnitten und den Sehnerv durchtrennt haben. Der Augapfel wurde mit einer Mikroklinge durch den Hornhautlimbus gestochen. Der Schnitt wurde als Eintrittspunkt verwendet, der es ermöglichte, entlang des Hornhaut-Sklera-Übergangs zu schneiden, indem eine Mikroschere durch die Inzisionsstelle eingeführt wurde. Es wurden kleine und kontinuierliche Schnitte entlang des Umfangs vorgenommen, bis sich die Becher trennten. Diese könnten weiter präpariert werden, indem die durchscheinende Schicht der neuralen Netzhaut mit einer Colibri-Nahzange sanft abgezogen wird, um die neurale Netzhaut und die RPE-Schichten zu erhalten. Ferner wurden drei/vier äquidistante Schnitte von der Peripherie senkrecht zum optischen Zentrum vorgenommen, bis der Sehnerv erreicht war. Dadurch öffneten sich die halbkugelförmigen Becher in eine Röschenform, so dass sie flach fielen und leicht montiert werden konnten. Diese Technik wurde in unserem Labor für Hornhaut-Wholemounts und Netzhautschnitte verwendet. Das Vorhandensein des dritten Augenlids beschreibt die nasal-zeitliche Orientierung, die die Untersuchung verschiedener zelltherapeutischer Interventionen nach der Transplantation und damit die gezielte physiologische Validierung ermöglicht, die für die Visualisierung und genaue Darstellung in solchen Studien unerlässlich ist.
Introduction
Die Augendissektion ist eine wichtige Technik in der ophthalmologischen Forschung und hat es den Forschern ermöglicht, für gezielte Studien auf die Augensegmente zuzugreifen. Früher verließen sich Augenforscher für ihre Studien auf das Augengewebe von erkrankten Personen. Die im Laufe der Jahre immer größer werdende Anzahl von Stämmen von ophthalmologischen Nagetiermodellen1 hat jedoch den Bedarf an menschlichem Augengewebe verringert. Diese Mausstämme haben ein tieferes Verständnis von Augenerkrankungen und Interventionen ermöglicht. Sie haben jedoch auch einen Bedarf an innovativen Techniken der okulären Mikrodissektion geweckt. Die geringe Größe und der begrenzte Arbeitsbereich schränken den effektiven Zugang zu den Augenunterteilen stark ein. Darüber hinaus ist es aufgrund der homogenen zellulären Anordnung der hinteren und vorderen Augenmuscheln schwierig, gezielte Eingriffe nach der Dissektion durchzuführen. Die derzeitigen Mikrodissektionstechniken des Lasers2 und der chirurgischen Mikrodissektion 3,4 reichen nicht aus, um diese Anforderungen der Augenforschung zu erfüllen. Die Laser-Mikrodissektion ist bei der Einzelzellanalyse sehr effektiv, aber das spezifische Gewebe muss vor dem Laserverfahren mikropräpariert werden2. Die Technik kann kleine Regionen von Interesse aus einem vorpräparierten Gewebe für die molekulare Analyse isolieren. Daher eignet sich die Technik nicht zur Herstellung von Ganzkörpern oder zur Isolierung von axial gepackten Augenschichten für eine optimale Visualisierung.
Die chirurgische Methode ist die am weitesten verbreitete Technik; Bei dieser Methode wird das Auge über den Sehnerv5 ruhiggestellt und anschließend die Dissektion durchgeführt. Diese Praxis ist mühsam und kann jedes zerbrechliche Gewebe beschädigen, da sich das sphärische Auge während der Dissektion weiter bewegt. Obwohl die Technik für die Isolierung der verschiedenen Abschnitte der Netzhautschichten vorteilhaft ist, kann sie die räumliche Orientierung des Gewebes bei der Dissektion nicht abgrenzen.
Während der Dissektion bietet die Aufrechterhaltung des Vorhandenseins der angebrachten Nickhaut oder des dritten Augenlids (Abbildung 1) einzigartige und signifikante Vorteile. Bei dieser Methode wird zunächst der Augapfel mit dem dritten Augenlid enukleiert. Dann wird das dritte Augenlid verwendet, um das Auge6 zu immobilisieren (Abbildung 2A). Es folgt das Durchstechen des Augapfels durch den Hornhautlimbus und die Verwendung des Einschnitts als Eintrittspunkt (Abbildung 2B, C). Dann werden die Augenmuscheln getrennt, indem entlang des Umfangs nach vorne und hinten geschnitten wird (Abbildung 2D-G). Durch eine weitere Präparation der hinteren Augenmuschel kann die durchscheinende Schicht der neuralen Netzhaut identifiziert und vorsichtig abgezogen werden. In den erhaltenen halbkugelförmigen vorderen und hinteren Schalen werden dann drei oder vier äquidistante Schnitte gemacht, die es diesen blütenförmigen Bechern ermöglichen, flach auf einen Objektträger zu fallen (Abbildung 2H).
Das dritte Augenlid ermöglicht eine einfache und effiziente Handhabung während der Dissektion und sorgt so für eine minimale Schädigung des Gewebes beim Zugang zu den verschiedenen Augenschichten und bei der Herstellung ganzer Halterungen. Darüber hinaus hilft das Vorhandensein des dritten Augenlids, lokalisierte Eingriffe während der Visualisierung zu lokalisieren und zu untersuchen.
Das Verfahren wurde in unserem Labor an einem CBA/J- oder einem rd1-Mausstamm bei P28 jeglichen Geschlechts durchgeführt. Das Verfahren kann an jedem Stamm, Alter oder Geschlecht des Tieres durchgeführt werden und hat keine Verzerrung gemäß diesen Merkmalen.
Die Tiere wurden aus kommerziellen Quellen beschafft (siehe Materialtabelle) und in der Small Animal Facility (SAF) des National Institute of Immunology (NII) gehalten. Sie wurden in einzeln belüfteten Käfigen (IVC) gehalten und erhielten ad libitum Zugang zu angesäuertem autoklaviertem Wasser und Nahrung. Sie wurden bei 21-23 °C und mit einem Hell-Dunkel-Zyklus von 14 h/10 h gehalten.
Im Folgenden ist eine modifizierte chirurgische Methode für die Mikrodissektion eines Mausauges angegeben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die okuläre Mikrodissektion hat sich aufgrund der geringen Größe und Kugelform des Nagetierauges als schwierige Aufgabe erwiesen, und das Nagetierauge erfordert innovative Techniken für eine effiziente Handhabung8.
Bei der derzeit demonstrierten Methode wird der enukleierte Mausaugapfel mit dem dritten Augenlid erhalten, um eine effektive und einfache Handhabung zu gewährleisten. Mit dem dritten Augenlid kann der Augapfel vollständig immobilisiert werden, wodurch…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Alaknanda Mishra, Department of Cell Biology and Human Anatomy, University of California Davis, USA, hat uns am National Institute of Immunology, New Delhi, in dieser Methode geschult. Diese Arbeit wurde durch den Hauptzuschuss unterstützt, den das Department of Biotechnology der indischen Regierung an das National Institute of Immunology, Neu-Delhi, erhalten hat. P.S. erhielt ein Forschungsstipendium des Instituts für Biotechnologie.
Materials
| Acetaminophen (Biocetamol) | EG Pharmaceuticals | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Betadine (Povidon-Iodine Solution) | Win-Medicare; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Biological safety cabinet ( Class I) | Kartos international; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| CBA/J inbred mice | The Jackson Laboratory | Stock No. 000654 | |
| Cefotaxime (Taxim) | AlKem ; India | cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Cell Strainer | Sigma ; US | CLS431752 | |
| Collagenase Type I | Gibco by Life Technologies | 17100-017 | |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd ; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| DPX Mountant | Sigma ; US | 6522 | |
| Drape Sheet | JSD Surgicals, Delhi, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma ; US | HT110132 | |
| Forceps | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Glucose | Himedia, India | GRM077 | |
| Hair removing cream (Veet) | Reckitt Benckiser , India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma ; US | MHS16 | |
| Heparin sodium salt | Himedia; India | RM554 | |
| Hyaluronidase From Sheep Testes | Sigma ; US | H6254 | |
| I.V. Cannula (Plusflon) | Mediplus, India | Ref 1732411420 | |
| Insulin Syringes | BD ; US | REF 303060 | |
| Isoflurane ( Forane) | Asecia Queenborough | No B506 | Inhalation Anaesthetic |
| Ketamine (Ketamax) | Troikaa Pharmaceuticals Ltd. | Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Meloxicam (Melonex) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Micro needle holders straight & curved | Mercian ; England | BS-13-8 | |
| Micro needle holders straight & curved |
Mercian ; England | BS-13-8 | |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Nylon Thread | Mighty ; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Refresh Tears/Eyemist Gel | Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India | P3060 | No specific Catalog Number |
| RPMI | Himedia; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scalpel | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scissors | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation ; US | No specific Catalog Number | |
| Sucrose | Sigma ; US | S0389 | |
| Surgical Blade No. 22 | La Medcare, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical Board | Locally made | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical White Tape | 3M India ; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Sutures | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| Syringes (1ml, 26 G) | Dispo Van; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Trimmer (Clipper) | Philips | NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005 | |
| Weighing Machine | Braun | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| William's E Media | Himedia; India | AT125 | |
| Xylazine (Xylaxin) | Indian Immunologicals Limited | Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant |
Referências
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