げっ歯類の目の微小解剖
Summary
この論文は、げっ歯類の眼の微小解離のためのプロトコルを提示します。このプロセスには、刺激膜(すなわち、第3のまぶた)とともに眼球の除核が含まれます。その後、後眼カップと前眼カップが分離します。
Abstract
げっ歯類の眼の微小解離は、前眼および後眼カップを得るために、付着した窒化膜または第3まぶたを有する除核眼球のセグメンテーションを含む。この技術により、角膜組織、神経組織、網膜色素上皮(RPE)組織、および水晶体を含む眼のサブパーツを、特定の眼組織のホールマウント、凍結切片、および/または単一細胞懸濁液のために得ることができる。第3のまぶたの存在は、局所的な介入後の眼の生理学を理解するために、または眼の空間地形に関連する眼の分析を含む研究において重要な眼の向きの維持に利益をもたらすため、独特で重要な利点を提示する。
この方法では、眼窩と第三まぶたの眼球を慎重にゆっくりと切断し、視神経を切断します。眼球は、マイクロブレードを使用して角膜辺縁部に突き刺されました。切開部を入口とし、切開点からマイクロハサミを挿入することで角膜-強膜接合部に沿って切断することができました。カップが分離するまで、円周に沿って小さく連続したカットが行われました。これらは、コリブリ縫合鉗子を使用して神経網膜の半透明層を穏やかに剥離し、神経網膜およびRPE層を得ることによってさらに解剖することができた。さらに、視神経に達するまで、周辺から視神経中心に垂直に3/4の等距離の切り込みが行われました。これにより、半球形のカップが小花の形に開き、平らになり、簡単に取り付けることができました。この技術は、私たちの研究室で角膜全体マウントと網膜切片に使用されています。3番目のまぶたの存在は、鼻側頭方向を描写し、移植後のさまざまな細胞療法介入の研究を可能にし、したがって、そのような研究での視覚化と正確な表現に不可欠なターゲットを絞った生理学的検証を可能にします。
Introduction
眼科解離は眼科研究における重要な技術であり、研究者は標的研究のために眼のセグメントにアクセスすることができました。以前は、眼の研究者は彼らの研究のために病気の個人の眼組織に頼っていました。しかし、眼科げっ歯類モデル1の系統が長年にわたって徐々に増加しているため、ヒトの眼組織の必要性が減少しています。これらのマウス系統は、眼疾患と介入のより深い理解を可能にしました。しかし、彼らはまた、眼の微小解剖の革新的な技術の必要性を生み出しました。サイズが小さく、操作領域が限られているため、眼のサブパーツへの効果的なアクセスが大幅に制限されます。さらに、後眼眉および前眼眉の細胞集合が均質であるため、解剖後に標的介入を行うことは困難である。レーザー2と外科的マイクロダイセクション3,4の現在のマイクロダイセクション技術は、眼科研究のそのような要件を満たすには不十分です。レーザーマイクロダイセクションはシングルセル分析に非常に効果的ですが、レーザー手順2の前に特定の組織をマイクロ解剖する必要があります。この技術は、分子分析のために事前に解剖された組織から関心のある小さな領域を分離することができます。したがって、この技術は、ホールマウントの準備や、最適な視覚化のための軸方向に詰め込まれた眼層の分離には適していません。
外科的方法は最も広く使用されている技術です。この方法は、視神経5を介して眼を固定し、次いで解剖を行うことを含む。この方法は骨の折れるものであり、解剖中に球形の目が動き続けるため、壊れやすい組織に損傷を与える可能性があります。網膜層のさまざまなセクションを分離するのに有益であるにもかかわらず、この技術は解剖時に組織の空間的配向を画定することはできません。
解剖中、付着した硝化膜または第3まぶた(図1)の存在を維持することは、ユニークで重要な利点を提示します。この方法では、まず、眼球を第3の眼瞼で除核する。そして、第3の眼瞼を用いて被検眼6を固定化する(図2A)。これに続いて、眼球を角膜辺縁に突き刺し、切開部を入口として使用します(図2B、C)。次に、円周に沿って前後に切断することにより、アイカップを分離します(図2D-G)。後眼カップをさらに解剖することにより、神経網膜の半透明層を特定し、穏やかに剥がすことができます。次に、得られた半球状の前部および後部カップに3つまたは4つの等距離の切り込みを入れ、これらの花の形のカップをスライド上に平らに落下させることができます(図2H)。
3番目のまぶたは、解剖中の簡単で効率的な取り扱いを支援し、さまざまな眼層にアクセスしたり、ホールマウントを作成したりする際に、組織への損傷を最小限に抑えます。さらに、3番目のまぶたの存在は、視覚化中の局所的な介入を見つけて調べるのに役立ちます。
私たちの研究室では、この手順は、あらゆる性別のP28のCBA / Jまたはrd1マウス系統で実行されています。この手順は、動物のあらゆる系統、年齢、または性別に対して実行でき、これらの特性に応じた偏りはありません。
動物は商業的な供給源から調達され( 材料表を参照)、国立免疫学研究所(NII)の小動物施設(SAF)で飼育されました。彼らは個々の換気ケージ(IVC)に保管され、酸性化されたオートクレーブ水と食物への 自由 アクセスを受けました。それらは21〜23°Cで、14時間/ 10時間の明暗サイクルで維持されました。
以下に、マウスの目の微小解剖のための修正された外科的方法を示します。
Protocol
Representative Results
Discussion
眼の微小解離は、げっ歯類の眼のサイズが小さく球形であるため困難な作業であることがわかっているが、げっ歯類の眼は効率的な取り扱いのための革新的な技術を必要とする8。
現在実証されている方法では、有効で簡単な取り扱いのために、第3のまぶたを取り付けた状態で除核したマウス眼球が得られます。3番目のまぶたを使用して、眼球を完全?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
米国カリフォルニア大学デービス校の細胞生物学および人体解剖学部のアラクナンダ・ミシュラ博士は、ニューデリーの国立免疫学研究所でこの方法を訓練しました。この研究は、インド政府のバイオテクノロジー省からニューデリーの国立免疫学研究所に受け取ったコア助成金によってサポートされました。P.S.はバイオテクノロジー学科から研究フェローシップを授与されました。
Materials
| Acetaminophen (Biocetamol) | EG Pharmaceuticals | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Betadine (Povidon-Iodine Solution) | Win-Medicare; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Biological safety cabinet ( Class I) | Kartos international; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| CBA/J inbred mice | The Jackson Laboratory | Stock No. 000654 | |
| Cefotaxime (Taxim) | AlKem ; India | cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Cell Strainer | Sigma ; US | CLS431752 | |
| Collagenase Type I | Gibco by Life Technologies | 17100-017 | |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd ; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| DPX Mountant | Sigma ; US | 6522 | |
| Drape Sheet | JSD Surgicals, Delhi, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma ; US | HT110132 | |
| Forceps | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Glucose | Himedia, India | GRM077 | |
| Hair removing cream (Veet) | Reckitt Benckiser , India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma ; US | MHS16 | |
| Heparin sodium salt | Himedia; India | RM554 | |
| Hyaluronidase From Sheep Testes | Sigma ; US | H6254 | |
| I.V. Cannula (Plusflon) | Mediplus, India | Ref 1732411420 | |
| Insulin Syringes | BD ; US | REF 303060 | |
| Isoflurane ( Forane) | Asecia Queenborough | No B506 | Inhalation Anaesthetic |
| Ketamine (Ketamax) | Troikaa Pharmaceuticals Ltd. | Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Meloxicam (Melonex) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Micro needle holders straight & curved | Mercian ; England | BS-13-8 | |
| Micro needle holders straight & curved |
Mercian ; England | BS-13-8 | |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Nylon Thread | Mighty ; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Refresh Tears/Eyemist Gel | Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India | P3060 | No specific Catalog Number |
| RPMI | Himedia; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scalpel | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scissors | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation ; US | No specific Catalog Number | |
| Sucrose | Sigma ; US | S0389 | |
| Surgical Blade No. 22 | La Medcare, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical Board | Locally made | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical White Tape | 3M India ; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Sutures | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| Syringes (1ml, 26 G) | Dispo Van; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Trimmer (Clipper) | Philips | NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005 | |
| Weighing Machine | Braun | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| William's E Media | Himedia; India | AT125 | |
| Xylazine (Xylaxin) | Indian Immunologicals Limited | Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant |
Referências
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