Summary
Denne artikkelen presenterer en protokoll for okulær mikrodisseksjon hos gnagere. Prosessen innebærer enukleasjon av øyebollet sammen med niktiterende membran (dvs. det tredje øyelokket). Dette følges deretter av separasjonen av de bakre og fremre øyekoppene.
Abstract
Den okulære mikrodisseksjonen av gnagerøyet involverer segmentering av det enucleated øyebollet med den vedlagte niktiterende membranen, eller tredje øyelokk, for å oppnå de fremre og bakre øyekoppene. Med denne teknikken kan underdelene av øyet, inkludert hornhinnen, nevralvev, retinalpigmentepitelial (RPE) vev og linse, oppnås for helmonteringer, kryoseksjonering og / eller enkeltcellesuspensjoner av et spesifikt okulært vev. Tilstedeværelsen av det tredje øyelokket gir unike og betydelige fordeler, da det fordeler vedlikeholdet av øyets orientering, noe som er viktig for å forstå øyefysiologi etter lokalisert inngrep eller i studier som involverer okulær analyse relatert til øyets romlige topografi.
I denne metoden enucleated vi øyebollet ved stikkontakten sammen med det tredje øyelokket ved forsiktig og sakte å kutte gjennom de ekstraokulære musklene og kutte optisk nerve. Øyeeplet ble gjennomboret gjennom hornhinnen limbus ved hjelp av et mikroblad. Snittet ble brukt som inngangspunkt, noe som gjorde det mulig å kutte langs hornhinnen-skleralkrysset ved å sette inn mikrosaks gjennom snittpunktet. Små og kontinuerlige kutt langs omkretsen ble gjort til koppene skilte seg. Disse kan dissekeres videre ved forsiktig å skrelle det gjennomsiktige laget av nevrale netthinnen ved hjelp av Colibri suturtang for å oppnå nevral retina og RPE-lag. Videre ble det gjort tre/fire ekvivalente kutt fra periferien vinkelrett på synssenteret inntil synsnerven var nådd. Dette åpnet de halvkuleformede koppene i en floretform slik at de falt flatt og lett kunne monteres. Denne teknikken har blitt brukt i vårt laboratorium for hornhinne wholemounts og retinal seksjoner. Tilstedeværelsen av det tredje øyelokket avgrenser nasal-temporal orientering, noe som muliggjør studier av ulike celleterapiintervensjoner etter transplantasjon og dermed den målrettede fysiologiske valideringen som er avgjørende for visualisering og nøyaktig representasjon i slike studier.
Introduction
Okulær disseksjon er en viktig teknikk i oftalmisk forskning og har gitt etterforskere tilgang til øyets segmenter for målrettede studier. Tidligere stolte okulære forskere på det okulære vevet fra syke individer for sine studier. Imidlertid har det gradvis økende antall stammer av oftalmiske gnagermodeller1 gjennom årene redusert behovet for humant okulært vev. Disse musestammene har tillatt en dypere forståelse av okulær sykdom og inngrep. Likevel har de også generert et behov for innovative teknikker for okulær mikrodisseksjon. Den lille størrelsen og det begrensede operasjonsområdet begrenser i stor grad effektiv tilgang til de okulære underdelene. Videre, på grunn av den homogene cellulære monteringen av bakre og fremre øyekopper, er det vanskelig å gjennomføre målrettede inngrep etter disseksjon. De nåværende mikrodisseksjonsteknikkene for laser2 og kirurgisk mikrodisseksjon 3,4 er utilstrekkelige for å oppfylle slike krav til okulær forskning. Lasermikrodisseksjon er svært effektiv i enkeltcelleanalyse, men det spesifikke vevet må mikrodissekeres før laserprosedyren2. Teknikken kan isolere små regioner av interesse fra et forhåndsdissekert vev for molekylær analyse. Dermed er teknikken ikke egnet for å forberede helmonteringer eller for isolering av aksialt pakkede okulære lag for optimal visualisering.
Den kirurgiske metoden er den mest brukte teknikken; Denne metoden innebærer immobilisering av øyet via synsnerven5 og deretter utføre disseksjonen. Denne praksisen er vanskelig og kan skade skjøre vev, da det sfæriske øyet fortsetter å bevege seg under disseksjon. Til tross for at det er gunstig for å isolere de forskjellige delene av retinallagene, kan teknikken ikke avgrense vevets romlige orientering ved disseksjon.
Under disseksjon gir opprettholdelse av tilstedeværelsen av den vedlagte niktiteringsmembranen eller det tredje øyelokket (figur 1) unike og betydelige fordeler. I denne metoden blir øyebollet først enucleated med det tredje øyelokket. Deretter brukes det tredje øyelokket til å immobilisere øyet6 (figur 2A). Dette etterfølges av å stikke hull i øyeeplet gjennom hornhinnen limbus og bruke snittet som inngangspunkt (figur 2B,C). Deretter skilles øyekoppene ved å skjære langs omkretsen anteriort og bakover (figur 2D-G). Ved å dissekere den bakre øyekoppen ytterligere, kan det gjennomsiktige laget av nevrale netthinnen identifiseres og forsiktig avskalles. Tre eller fire like fjerne kutt blir deretter laget i de oppnådde halvkuleformede fremre og bakre koppene, noe som gjør at disse blomsterformede koppene faller flatt på et lysbilde (figur 2H).
Det tredje øyelokket hjelper til med enkel og effektiv håndtering under disseksjonen, og sikrer dermed minimal skade på vevet mens du får tilgang til de forskjellige okulære lagene og når du produserer helmonteringer. Videre bidrar tilstedeværelsen av det tredje øyelokket til å lokalisere og undersøke lokaliserte inngrep under visualisering.
Prosedyren, i vårt laboratorium, har blitt utført på en CBA / J eller en rd1 musestamme ved P28 av noe kjønn. Prosedyren kan utføres på hvilken som helst stamme, alder eller kjønn av dyr og har ingen skjevhet i henhold til disse egenskapene.
Dyrene ble anskaffet fra kommersielle kilder (se materialfortegnelse) og vedlikeholdt ved Small Animal Facility (SAF) ved National Institute of Immunology (NII). De ble holdt i individuelle ventilerte bur (IVC) og fikk ad libitum-tilgang til forsuret autoklavert vann og mat. De ble opprettholdt ved 21-23 °C og med en lys/mørk syklus på 14 timer.
Nedenfor er en modifisert kirurgisk metode for mikrodisseksjon av et museøye.
Protocol
Representative Results
Discussion
Okulær mikrodisseksjon har vist seg å være en vanskelig oppgave på grunn av den lille størrelsen og sfæriske formen på gnagerøyet, og gnagerøyet krever innovative teknikker for effektiv håndtering8.
I den nåværende demonstrerte metoden oppnås det enucleated musens øyeboll med det tredje øyelokket festet for effektiv og enkel håndtering. Ved hjelp av det tredje øyelokket kan øyebollet immobiliseres helt, noe som gjør at disseksjonen kan fortsette med …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Alaknanda Mishra, Institutt for cellebiologi og menneskelig anatomi, University of California Davis, USA, trente oss i denne metoden ved National Institute of Immunology, New Delhi. Dette arbeidet ble støttet av kjernebevilgningen mottatt fra Institutt for bioteknologi, Indias regjering til National Institute of Immunology, New Delhi. P.S. ble stipendiat ved Institutt for bioteknologi.
Materials
| Acetaminophen (Biocetamol) | EG Pharmaceuticals | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Betadine (Povidon-Iodine Solution) | Win-Medicare; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Biological safety cabinet ( Class I) | Kartos international; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| CBA/J inbred mice | The Jackson Laboratory | Stock No. 000654 | |
| Cefotaxime (Taxim) | AlKem ; India | cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Cell Strainer | Sigma ; US | CLS431752 | |
| Collagenase Type I | Gibco by Life Technologies | 17100-017 | |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd ; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| DPX Mountant | Sigma ; US | 6522 | |
| Drape Sheet | JSD Surgicals, Delhi, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma ; US | HT110132 | |
| Forceps | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Glucose | Himedia, India | GRM077 | |
| Hair removing cream (Veet) | Reckitt Benckiser , India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma ; US | MHS16 | |
| Heparin sodium salt | Himedia; India | RM554 | |
| Hyaluronidase From Sheep Testes | Sigma ; US | H6254 | |
| I.V. Cannula (Plusflon) | Mediplus, India | Ref 1732411420 | |
| Insulin Syringes | BD ; US | REF 303060 | |
| Isoflurane ( Forane) | Asecia Queenborough | No B506 | Inhalation Anaesthetic |
| Ketamine (Ketamax) | Troikaa Pharmaceuticals Ltd. | Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Meloxicam (Melonex) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Micro needle holders straight & curved | Mercian ; England | BS-13-8 | |
| Micro needle holders straight & curved |
Mercian ; England | BS-13-8 | |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Nylon Thread | Mighty ; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Refresh Tears/Eyemist Gel | Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India | P3060 | No specific Catalog Number |
| RPMI | Himedia; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scalpel | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scissors | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation ; US | No specific Catalog Number | |
| Sucrose | Sigma ; US | S0389 | |
| Surgical Blade No. 22 | La Medcare, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical Board | Locally made | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical White Tape | 3M India ; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Sutures | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| Syringes (1ml, 26 G) | Dispo Van; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Trimmer (Clipper) | Philips | NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005 | |
| Weighing Machine | Braun | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| William's E Media | Himedia; India | AT125 | |
| Xylazine (Xylaxin) | Indian Immunologicals Limited | Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant |
Referências
- Choi, Y., et al. Studying cancer immunotherapy using patient-derived xenografts (PDXs) in humanized mice. Experimental and Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).
- Sutherland, C., et al. Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis. J Vis Exp. (136), e57576 (2018).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).
- Claybon, A., Bishop, A. J. Dissection of a mouse eye for a whole mount of the retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (48), e2563 (2011).
- Steven, P., et al. Experimental induction and three-dimensional two-photon imaging of conjunctiva-associated lymphoid tissue. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (4), 1512-1517 (2008).
- Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo. Journal of Visualized Experiments. (77), e50546 (2013).
- Ullmann, J. F., Moore, B. A., Temple, S. E., Fernandez-Juricic, E., Collin, S. P. The retinal wholemount technique: A window to understanding the brain and behaviour. Brain, Behavior and Evolution. 79 (1), 26-44 (2012).
- Nakao, S., Hafezi-Moghadam, A., Ishibashi, T. Lymphatics and lymphangiogenesis in the eye. Journal of Ophthalmology. 2012, 783163 (2012).
- Mishra, A., et al. Peripheral blood-derived monocytes show neuronal properties and integration in immune-deficient rd1 mouse model upon phenotypic differentiation and induction with retinal growth factors. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 412 (2020).
