Summary
Este trabalho apresenta um protocolo para microdissecção ocular em roedores. O processo envolve a enucleação do globo ocular junto com a membrana nictitante (ou seja, a terceira pálpebra). Isto é seguido pela separação dos copos oculares posterior e anterior.
Abstract
A microdissecção ocular do olho de roedor envolve a segmentação do globo ocular enucleado com a membrana nictitante anexada, ou terceira pálpebra, para obter os óculos anterior e posterior. Com esta técnica, as subpartes do olho, incluindo o tecido da córnea, tecido neural, tecido epitelial pigmentar da retina (PSE) e lente, podem ser obtidas para montagens inteiras, crio-seccionamento e / ou suspensões unicelulares de um tecido ocular específico. A presença da terceira pálpebra apresenta vantagens únicas e significativas, pois beneficia a manutenção da orientação do olho, o que é importante para a compreensão da fisiologia ocular após qualquer intervenção localizada ou em estudos envolvendo análise ocular relacionada à topografia espacial do olho.
Neste método, enucleamos o globo ocular na órbita juntamente com a terceira pálpebra, cortando cuidadosa e lentamente os músculos extraoculares e cortando o nervo óptico. O globo ocular foi perfurado através do limbo corneano usando uma microlâmina. A incisão foi utilizada como ponto de entrada, permitindo o corte ao longo da junção córnea-escleral por meio da inserção de microtesouras através do ponto de incisão. Pequenos e contínuos cortes ao longo da circunferência foram feitos até que os copos se separassem. Estes poderiam ser ainda mais dissecados descascando suavemente a camada translúcida da retina neural usando pinça de sutura de Colibri para obter as camadas de retina neural e RPE. Além disso, três/quatro cortes equidistantes foram feitos da periferia perpendicularmente ao centro óptico até que o nervo óptico fosse atingido. Isso abriu os copos hemisféricos em forma de flor para que eles caíssem e pudessem ser facilmente montados. Esta técnica tem sido usada em nosso laboratório para montagens inteiras da córnea e seções da retina. A presença da terceira pálpebra delineia a orientação nasal-temporal, o que permite o estudo de diversas intervenções de terapia celular pós-transplante e, assim, a validação fisiológica direcionada vital para visualização e representação precisa em tais estudos.
Introduction
A dissecção ocular é uma técnica importante na pesquisa oftálmica e tem permitido que os investigadores acessem os segmentos do olho para estudos direcionados. Anteriormente, os pesquisadores oculares confiavam no tecido ocular de indivíduos doentes para seus estudos. No entanto, o número progressivamente crescente de cepas de roedores oftálmicos modelos1 ao longo dos anos diminuiu a necessidade de tecido ocular humano. Essas cepas de camundongos permitiram uma compreensão mais profunda das doenças oculares e intervenções. No entanto, eles também geraram a necessidade de técnicas inovadoras de microdissecção ocular. O pequeno tamanho e a área limitada de operação restringem severamente o acesso efetivo às subpartes oculares. Além disso, devido à montagem celular homogênea dos copos oculares posterior e anterior, é difícil realizar intervenções direcionadas pós-dissecção. As técnicas atuais de microdissecção do laser2 e da microdissecção cirúrgica 3,4 são inadequadas para atender a tais exigências da pesquisa ocular. A microdissecção a laser é muito eficaz na análise de célula única, mas o tecido específico precisa ser microdissecado antes do procedimento a laser2. A técnica pode isolar pequenas regiões de interesse de um tecido pré-dissecado para análise molecular. Assim, a técnica não é adequada para a preparação de montagens inteiras ou para o isolamento de camadas oculares axialmente compactadas para uma visualização ideal.
O método cirúrgico é a técnica mais utilizada; este método envolve imobilizar o olho através do nervo óptico5 e, em seguida, realizar a dissecção. Esta prática é árdua e pode danificar qualquer tecido frágil, pois o olho esférico continua a se mover durante a dissecção. Apesar de ser benéfica para isolar as várias seções das camadas da retina, a técnica não pode demarcar a orientação espacial do tecido após a dissecção.
Durante a dissecção, a manutenção da presença da membrana nictitante aderida ou da terceira pálpebra (Figura 1) apresenta vantagens únicas e significativas. Neste método, primeiro, o globo ocular é enucleado com a terceira pálpebra. Em seguida, a terceira pálpebra é utilizada para imobilizar o olho6 (Figura 2A). Segue-se a perfuração do globo ocular através do limbo corneano e a incisão como ponto de entrada (Figura 2B,C). Em seguida, os óculos são separados por corte ao longo da circunferência anterior e posteriormente (Figura 2D-G). Ao dissecar ainda mais o óculo posterior, a camada translúcida da retina neural pode ser identificada e suavemente descascada. Em seguida, são feitos três ou quatro cortes equidistantes nos copos hemisféricos anterior e posterior obtidos, que permitem que esses copos em forma de flor caiam sobre uma lâmina (Figura 2H).
A terceira pálpebra auxilia no manuseio fácil e eficiente durante a dissecção, garantindo assim danos mínimos ao tecido ao acessar as várias camadas oculares e ao produzir montagens inteiras. Além disso, a presença da terceira pálpebra ajuda a localizar e examinar intervenções localizadas durante a visualização.
O procedimento, em nosso laboratório, foi realizado em uma cepa de camundongo CBA/J ou rd1 em P28 de qualquer sexo. O procedimento pode ser realizado em qualquer cepa, idade ou sexo do animal e não tem viés de acordo com essas características.
Os animais foram adquiridos de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais) e mantidos no Small Animal Facility (SAF) do Instituto Nacional de Imunologia (NII). Eles foram mantidos em gaiolas ventiladas individuais (VCI) e receberam acesso ad libitum a água e alimentos autoclavados acidificados. Foram mantidos a 21-23 °C e com ciclo claro/escuro de 14 h/10 h.
Dado abaixo é um método cirúrgico modificado para a micro-dissecção de um olho de rato.
Protocol
Representative Results
Discussion
A microdissecção ocular tem sido considerada uma tarefa difícil devido ao pequeno tamanho e forma esférica do olho do roedor, e o olho do roedor requer técnicas inovadoras para o manuseio eficiente8.
No método demonstrado atualmente, o globo ocular de rato enucleado é obtido com a terceira pálpebra presa para um manuseio eficaz e fácil. Usando a terceira pálpebra, o globo ocular pode ser imobilizado completamente, o que permite que a dissecção prossiga com …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A Dra. Alaknanda Mishra, Departamento de Biologia Celular e Anatomia Humana, Universidade da Califórnia em Davis, EUA, nos treinou neste método no Instituto Nacional de Imunologia, Nova Delhi. Este trabalho foi apoiado pela subvenção principal recebida do Departamento de Biotecnologia, Governo da Índia para o Instituto Nacional de Imunologia, Nova Deli. P.S. recebeu uma bolsa de pesquisa do Departamento de Biotecnologia.
Materials
| Acetaminophen (Biocetamol) | EG Pharmaceuticals | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Betadine (Povidon-Iodine Solution) | Win-Medicare; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Biological safety cabinet ( Class I) | Kartos international; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| CBA/J inbred mice | The Jackson Laboratory | Stock No. 000654 | |
| Cefotaxime (Taxim) | AlKem ; India | cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Cell Strainer | Sigma ; US | CLS431752 | |
| Collagenase Type I | Gibco by Life Technologies | 17100-017 | |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd ; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| DPX Mountant | Sigma ; US | 6522 | |
| Drape Sheet | JSD Surgicals, Delhi, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma ; US | HT110132 | |
| Forceps | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Glucose | Himedia, India | GRM077 | |
| Hair removing cream (Veet) | Reckitt Benckiser , India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma ; US | MHS16 | |
| Heparin sodium salt | Himedia; India | RM554 | |
| Hyaluronidase From Sheep Testes | Sigma ; US | H6254 | |
| I.V. Cannula (Plusflon) | Mediplus, India | Ref 1732411420 | |
| Insulin Syringes | BD ; US | REF 303060 | |
| Isoflurane ( Forane) | Asecia Queenborough | No B506 | Inhalation Anaesthetic |
| Ketamine (Ketamax) | Troikaa Pharmaceuticals Ltd. | Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Meloxicam (Melonex) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Micro needle holders straight & curved | Mercian ; England | BS-13-8 | |
| Micro needle holders straight & curved |
Mercian ; England | BS-13-8 | |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Nylon Thread | Mighty ; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Refresh Tears/Eyemist Gel | Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India | P3060 | No specific Catalog Number |
| RPMI | Himedia; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scalpel | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scissors | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation ; US | No specific Catalog Number | |
| Sucrose | Sigma ; US | S0389 | |
| Surgical Blade No. 22 | La Medcare, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical Board | Locally made | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical White Tape | 3M India ; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Sutures | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| Syringes (1ml, 26 G) | Dispo Van; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Trimmer (Clipper) | Philips | NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005 | |
| Weighing Machine | Braun | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| William's E Media | Himedia; India | AT125 | |
| Xylazine (Xylaxin) | Indian Immunologicals Limited | Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant |
Referências
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