Mikrodissektion av gnagareögat
Summary
Detta dokument presenterar ett protokoll för okulär mikrodissektion hos gnagare. Processen innefattar enukleation av ögongloben tillsammans med det nictiterande membranet (dvs det tredje ögonlocket). Detta följs sedan av separationen av de bakre och främre ögonkopparna.
Abstract
Den okulära mikrodissektionen av gnagarögat innefattar segmentering av den enukleerade ögongloben med det bifogade nictiterande membranet, eller tredje ögonlocket, för att erhålla de främre och bakre ögonmusslorna. Med denna teknik kan underdelarna av ögat, inklusive hornhinnans vävnad, nervvävnad, retinal pigmentepitelvävnad (RPE) och lins, erhållas för helmontering, kryosnitt och / eller encellssuspensioner av en specifik okulär vävnad. Närvaron av det tredje ögonlocket ger unika och signifikanta fördelar, eftersom det gynnar upprätthållandet av ögats orientering, vilket är viktigt för att förstå ögonfysiologi efter lokaliserad intervention eller i studier som involverar okulär analys relaterad till ögats rumsliga topografi.
I denna metod utlöste vi ögongloben vid uttaget tillsammans med det tredje ögonlocket genom att försiktigt och långsamt skära igenom de extraokulära musklerna och skära av synnerven. Ögongloben genomborrades genom hornhinnans limbus med hjälp av ett mikroblad. Snittet användes som ingångspunkt, vilket möjliggjorde skärning längs hornhinnan-sklerala korsningen genom att sätta in mikrosax genom snittpunkten. Små och kontinuerliga snitt längs omkretsen gjordes tills kopparna separerades. Dessa kan dissekeras ytterligare genom att försiktigt skala det genomskinliga lagret av den neurala näthinnan med hjälp av Colibri suturing pincett för att erhålla neurala näthinnan och RPE-skikten. Vidare gjordes tre/fyra lika avlägsna snitt från periferin vinkelrätt mot det optiska centrumet tills synnerven nåddes. Detta öppnade de halvklotformade kopparna i en florettform så att de föll platt och lätt kunde monteras. Denna teknik har använts i vårt laboratorium för hornhinnans helfästen och näthinnesektioner. Närvaron av det tredje ögonlocket avgränsar den nasal-temporala orienteringen, vilket möjliggör studier av olika cellterapiinterventioner efter transplantation och därmed den riktade fysiologiska valideringen som är avgörande för visualisering och korrekt representation i sådana studier.
Introduction
Okulär dissektion är en viktig teknik inom oftalmisk forskning och har gjort det möjligt för utredare att få tillgång till ögonsegmenten för riktade studier. Tidigare förlitade sig okulära forskare på ögonvävnaden från sjuka individer för sina studier. Det successivt växande antalet stammar av oftalmiska gnagarmodeller1 genom åren har dock minskat behovet av mänsklig ögonvävnad. Dessa musstammar har möjliggjort en djupare förståelse av ögonsjukdom och interventioner. Ändå har de också skapat ett behov av innovativa tekniker för okulär mikrodissektion. Den lilla storleken och det begränsade verksamhetsområdet begränsar allvarligt effektiv åtkomst till de okulära underdelarna. På grund av den homogena cellulära sammansättningen av de bakre och främre ögonmusslorna är det dessutom svårt att genomföra riktade ingrepp efter dissektion. De nuvarande mikrodissektionsteknikerna för laser2 och kirurgisk mikrodissektion 3,4 är otillräckliga för att uppfylla sådana krav på okulär forskning. Lasermikrodissektion är mycket effektiv vid encellsanalys, men den specifika vävnaden måste mikrodissekeras före laserproceduren2. Tekniken kan isolera små intressanta områden från en fördissekerad vävnad för molekylanalys. Således är tekniken inte lämplig för att förbereda helmonterade eller för isolering av axiellt packade okulära skikt för optimal visualisering.
Den kirurgiska metoden är den mest använda tekniken; Denna metod innebär immobilisering av ögat via synnerven5 och sedan utföra dissektionen. Denna övning är svår och kan skada all ömtålig vävnad, eftersom det sfäriska ögat fortsätter att röra sig under dissektion. Trots att den är fördelaktig för att isolera de olika sektionerna av näthinneskikten, kan tekniken inte avgränsa vävnadens rumsliga orientering vid dissektion.
Under dissektion ger upprätthållandet av närvaron av det bifogade nictiterande membranet eller det tredje ögonlocket (figur 1) unika och signifikanta fördelar. I denna metod är ögongloben först enukleerad med det tredje ögonlocket. Sedan används det tredje ögonlocket för att immobilisera ögat6 (figur 2A). Detta följs av att genomborra ögongloben genom hornhinnans limbus och använda snittet som ingångspunkt (figur 2B, C). Därefter separeras ögonmusslorna genom att skära längs omkretsen framåt och bakåt (figur 2D-G). Genom att dissekera den bakre ögonmusslan ytterligare kan det genomskinliga skiktet i den neurala näthinnan identifieras och försiktigt skalas av. Tre eller fyra lika avlägsna snitt görs sedan i de erhållna halvklotformiga främre och bakre kopparna, vilket gör att dessa blomformade koppar kan falla platt på en bild (figur 2H).
Det tredje ögonlocket hjälper till med enkel och effektiv hantering under dissektionen, vilket säkerställer minimal skada på vävnaden vid åtkomst till de olika okulära skikten och vid produktion av helfästen. Vidare hjälper närvaron av det tredje ögonlocket att lokalisera och undersöka lokaliserade ingrepp under visualisering.
Proceduren, i vårt labb, har utförts på en CBA / J eller en rd1 musstam vid P28 av vilket kön som helst. Förfarandet kan utföras på vilken stam, ålder eller kön som helst av djur och har ingen bias enligt dessa egenskaper.
Djuren anskaffades från kommersiella källor (se materialförteckning) och hölls vid Small Animal Facility (SAF) vid National Institute of Immunology (NII). De hölls i individuella ventilerade burar (IVC) och fick ad libitum tillgång till surgjort autoklaverat vatten och mat. De hölls vid 21-23 °C och med en 14 h/10 h ljus/mörk cykel.
Nedan ges en modifierad kirurgisk metod för mikrodissektion av ett musöga.
Protocol
Representative Results
Discussion
Okulär mikrodissektion har visat sig vara en svår uppgift på grund av gnagarögats lilla storlek och sfäriska form, och gnagarögat kräver innovativa tekniker för effektiv hantering8.
I den nuvarande demonstrerade metoden erhålls den enukleerade musögongloben med det tredje ögonlocket fäst för effektiv och enkel hantering. Med hjälp av det tredje ögonlocket kan ögongloben immobiliseras helt, vilket gör att dissektionen kan fortsätta med lätthet och med…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Alaknanda Mishra, Institutionen för cellbiologi och mänsklig anatomi, University of California Davis, USA, utbildade oss i denna metod vid National Institute of Immunology, New Delhi. Detta arbete stöddes av kärnbidraget från Institutionen för bioteknik, Indiens regering till National Institute of Immunology, New Delhi. P.S. beviljades ett forskarstipendium av institutionen för bioteknik.
Materials
| Acetaminophen (Biocetamol) | EG Pharmaceuticals | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Betadine (Povidon-Iodine Solution) | Win-Medicare; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Biological safety cabinet ( Class I) | Kartos international; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| CBA/J inbred mice | The Jackson Laboratory | Stock No. 000654 | |
| Cefotaxime (Taxim) | AlKem ; India | cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Cell Strainer | Sigma ; US | CLS431752 | |
| Collagenase Type I | Gibco by Life Technologies | 17100-017 | |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd ; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| DPX Mountant | Sigma ; US | 6522 | |
| Drape Sheet | JSD Surgicals, Delhi, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma ; US | HT110132 | |
| Forceps | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Glucose | Himedia, India | GRM077 | |
| Hair removing cream (Veet) | Reckitt Benckiser , India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma ; US | MHS16 | |
| Heparin sodium salt | Himedia; India | RM554 | |
| Hyaluronidase From Sheep Testes | Sigma ; US | H6254 | |
| I.V. Cannula (Plusflon) | Mediplus, India | Ref 1732411420 | |
| Insulin Syringes | BD ; US | REF 303060 | |
| Isoflurane ( Forane) | Asecia Queenborough | No B506 | Inhalation Anaesthetic |
| Ketamine (Ketamax) | Troikaa Pharmaceuticals Ltd. | Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Meloxicam (Melonex) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Micro needle holders straight & curved | Mercian ; England | BS-13-8 | |
| Micro needle holders straight & curved |
Mercian ; England | BS-13-8 | |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Nylon Thread | Mighty ; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Refresh Tears/Eyemist Gel | Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India | P3060 | No specific Catalog Number |
| RPMI | Himedia; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scalpel | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scissors | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation ; US | No specific Catalog Number | |
| Sucrose | Sigma ; US | S0389 | |
| Surgical Blade No. 22 | La Medcare, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical Board | Locally made | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical White Tape | 3M India ; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Sutures | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| Syringes (1ml, 26 G) | Dispo Van; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Trimmer (Clipper) | Philips | NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005 | |
| Weighing Machine | Braun | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| William's E Media | Himedia; India | AT125 | |
| Xylazine (Xylaxin) | Indian Immunologicals Limited | Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant |
Referências
- Choi, Y., et al. Studying cancer immunotherapy using patient-derived xenografts (PDXs) in humanized mice. Experimental and Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).
- Sutherland, C., et al. Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis. J Vis Exp. (136), e57576 (2018).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).
- Claybon, A., Bishop, A. J. Dissection of a mouse eye for a whole mount of the retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (48), e2563 (2011).
- Steven, P., et al. Experimental induction and three-dimensional two-photon imaging of conjunctiva-associated lymphoid tissue. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (4), 1512-1517 (2008).
- Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo. Journal of Visualized Experiments. (77), e50546 (2013).
- Ullmann, J. F., Moore, B. A., Temple, S. E., Fernandez-Juricic, E., Collin, S. P. The retinal wholemount technique: A window to understanding the brain and behaviour. Brain, Behavior and Evolution. 79 (1), 26-44 (2012).
- Nakao, S., Hafezi-Moghadam, A., Ishibashi, T. Lymphatics and lymphangiogenesis in the eye. Journal of Ophthalmology. 2012, 783163 (2012).
- Mishra, A., et al. Peripheral blood-derived monocytes show neuronal properties and integration in immune-deficient rd1 mouse model upon phenotypic differentiation and induction with retinal growth factors. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 412 (2020).
