Kemirgen Gözün Mikrodiseksiyonu
Summary
Bu yazıda kemirgenlerde oküler mikrodiseksiyon için bir protokol sunulmaktadır. İşlem, göz küresinin niktitasyon zarı (yani üçüncü göz kapağı) ile birlikte enükleasyonunu içerir. Bunu daha sonra arka ve ön göz kapaklarının ayrılması izler.
Abstract
Kemirgen gözünün oküler mikro diseksiyonu, ön ve arka göz kapaklarını elde etmek için enüklee edilmiş göz küresinin bağlı niktitasyon zarı veya üçüncü göz kapağı ile segmentasyonunu içerir. Bu teknikle, kornea dokusu, sinir dokusu, retinal pigment epitel (RPE) dokusu ve lens dahil olmak üzere gözün alt kısımları, belirli bir oküler dokunun bütünlemeleri, kriyo-kesitleme ve / veya tek hücreli süspansiyonları için elde edilebilir. Üçüncü göz kapağının varlığı, herhangi bir lokalize müdahaleyi takiben veya gözün uzamsal topografisi ile ilgili oküler analizi içeren çalışmalarda göz fizyolojisini anlamak için önemli olan gözün oryantasyonunun korunmasına fayda sağladığı için benzersiz ve önemli avantajlar sunar.
Bu yöntemde, göz dışı kasları dikkatlice ve yavaşça keserek ve optik siniri keserek üçüncü göz kapağı ile birlikte yuvadaki göz küresini enüklee ettik. Göz küresi bir mikrobıçak kullanılarak kornea limbusundan delindi. Kesi, giriş noktası olarak kullanıldı ve kesi noktasından mikro makas yerleştirilerek kornea-skleral bileşke boyunca kesime izin verildi. Bardaklar ayrılana kadar çevre boyunca küçük ve sürekli kesimler yapıldı. Bunlar, nöral retina ve RPE katmanlarını elde etmek için Colibri dikiş forseps kullanılarak nöral retinanın yarı saydam tabakasının hafifçe soyulmasıyla daha da diseke edilebilir. Ayrıca, optik sinire ulaşılana kadar periferden optik merkeze dik olarak üç/dört eşit uzaklıkta kesim yapıldı. Bu, yarım küre şeklindeki bardakları çiçek şeklinde açtı, böylece düz düştüler ve kolayca monte edilebildiler. Bu teknik laboratuvarımızda kornea kepçeleri ve retina kesitleri için kullanılmıştır. Üçüncü göz kapağının varlığı, nakil sonrası çeşitli hücre tedavisi müdahalelerinin incelenmesine izin veren nazal-temporal oryantasyonu ve dolayısıyla bu tür çalışmalarda görselleştirme ve doğru temsil için hayati önem taşıyan hedeflenen fizyolojik doğrulamayı tanımlar.
Introduction
Oküler diseksiyon, oftalmik araştırmalarda önemli bir tekniktir ve araştırmacıların hedeflenen çalışmalar için gözün segmentlerine erişmelerine izin vermiştir. Daha önce, oküler araştırmacılar, çalışmaları için hastalıklı bireylerin oküler dokusuna güveniyorlardı. Bununla birlikte, yıllar içinde oftalmik kemirgen modellerinin1 suşlarının sayısının giderek artması, insan oküler dokusuna olan ihtiyacı azaltmıştır. Bu fare suşları, oküler hastalık ve müdahalelerin daha derin bir şekilde anlaşılmasını sağlamıştır. Bununla birlikte, oküler mikro-diseksiyonun yenilikçi tekniklerine de ihtiyaç duymuşlardır. Küçük boyut ve sınırlı operasyon alanı, oküler alt parçalara etkili erişimi ciddi şekilde kısıtlar. Ayrıca, posterior ve anterior vizör kapaklarının homojen hücresel montajı nedeniyle, diseksiyon sonrası hedefe yönelik müdahalelerin yapılması zordur. Lazer2 ve cerrahi mikrodiseksiyon 3,4’ün mevcut mikrodiseksiyon teknikleri, oküler araştırmaların bu gereksinimlerini karşılamada yetersizdir. Lazer mikro-diseksiyonu tek hücreli analizde çok etkilidir, ancak spesifik dokunun lazer prosedürü2’den önce mikro diseke edilmesi gerekir. Teknik, moleküler analiz için küçük ilgi alanlarını önceden disseke edilmiş bir dokudan izole edebilir. Bu nedenle, teknik tüm montajların hazırlanması veya optimum görselleştirme için eksenel olarak paketlenmiş oküler tabakaların izolasyonu için uygun değildir.
Cerrahi yöntem en çok kullanılan tekniktir; Bu yöntem, gözün optik sinir5 yoluyla hareketsiz hale getirilmesini ve daha sonra diseksiyonun yapılmasını içerir. Bu uygulama zordur ve diseksiyon sırasında küresel göz hareket etmeye devam ettiği için herhangi bir kırılgan dokuya zarar verebilir. Retina tabakalarının çeşitli bölümlerini izole etmek için faydalı olmasına rağmen, teknik diseksiyon üzerine dokunun uzamsal yönelimini belirleyemez.
Diseksiyon sırasında, bağlı niktitasyon zarının veya üçüncü göz kapağının varlığını korumak (Şekil 1) benzersiz ve önemli avantajlar sunar. Bu yöntemde öncelikle üçüncü göz kapağı ile göz küresi enüklee edilir. Daha sonra, üçüncü göz kapağı gözüimmobilize etmek için kullanılır 6 (Şekil 2A). Bunu göz küresinin kornea limbusundan delinmesi ve insizyonun giriş noktası olarak kullanılması izler (Şekil 2B,C). Daha sonra vizör kapakları ön ve arka çevre boyunca kesilerek ayrılır (Şekil 2D-G). Arka vizör adaptörünü daha da diseke ederek, nöral retinanın yarı saydam tabakası tanımlanabilir ve nazikçe soyulabilir. Daha sonra elde edilen yarım küre şeklindeki ön ve arka bardaklarda üç veya dört eşit mesafeli kesim yapılır, bu da bu çiçek şeklindeki bardakların bir slayt üzerine düz bir şekilde düşmesine izin verir (Şekil 2H).
Üçüncü göz kapağı, diseksiyon sırasında kolay ve verimli bir şekilde kullanılmasına yardımcı olur, böylece çeşitli oküler tabakalara erişirken ve bütünsel montajlar üretirken dokuya minimum hasar verir. Ayrıca, üçüncü göz kapağının varlığı, görselleştirme sırasında lokalize müdahalelerin bulunmasına ve incelenmesine yardımcı olur.
Prosedürümüz, laboratuarımızda, herhangi bir cinsiyetin P28’inde bir CBA / J veya rd1 fare suşu üzerinde gerçekleştirilmiştir. Prosedür, hayvanın herhangi bir suşu, yaşı veya cinsiyeti üzerinde yapılabilir ve bu özelliklere göre önyargısı yoktur.
Hayvanlar ticari kaynaklardan temin edildi ( bakınız Malzeme Tablosu) ve Ulusal İmmünoloji Enstitüsü’ndeki (NII) Küçük Hayvan Tesisi’nde (SAF) muhafaza edildi. Bireysel havalandırmalı kafeslerde (IVC) tutuldular ve asitleştirilmiş otoklavlanmış suya ve yiyeceğe ad libitum erişimi aldılar. 21-23 ° C’de ve 14 saat / 10 saat açık / karanlık döngüsünde tutuldular.
Aşağıda verilen, bir fare gözünün mikro diseksiyonu için modifiye edilmiş bir cerrahi yöntemdir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Oküler mikrodiseksiyonun, kemirgen gözünün küçük boyutu ve küresel şekli nedeniyle zor bir görev olduğu bulunmuştur ve kemirgen gözü, etkili kullanım için yenilikçi teknikler gerektirir8.
Mevcut gösterilen yöntemde, enüklee fare göz küresi, etkili ve kolay kullanım için takılı üçüncü göz kapağı ile elde edilir. Üçüncü göz kapağını kullanarak, göz küresi tamamen hareketsiz hale getirilebilir, bu da diseksiyonun kolaylıkla ve m…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ABD’deki California Davis Üniversitesi, Hücre Biyolojisi ve İnsan Anatomisi Bölümü’nden Dr. Alaknanda Mishra, Yeni Delhi’deki Ulusal İmmünoloji Enstitüsü’nde bizi bu yöntemde eğitti. Bu çalışma, Hindistan Hükümeti Biyoteknoloji Bölümü’nden Yeni Delhi Ulusal İmmünoloji Enstitüsü’ne verilen temel hibe ile desteklenmiştir. PS’ye Biyoteknoloji Bölümü tarafından araştırma bursu verildi.
Materials
| Acetaminophen (Biocetamol) | EG Pharmaceuticals | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Betadine (Povidon-Iodine Solution) | Win-Medicare; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Biological safety cabinet ( Class I) | Kartos international; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| CBA/J inbred mice | The Jackson Laboratory | Stock No. 000654 | |
| Cefotaxime (Taxim) | AlKem ; India | cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Cell Strainer | Sigma ; US | CLS431752 | |
| Collagenase Type I | Gibco by Life Technologies | 17100-017 | |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd ; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| DPX Mountant | Sigma ; US | 6522 | |
| Drape Sheet | JSD Surgicals, Delhi, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma ; US | HT110132 | |
| Forceps | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Glucose | Himedia, India | GRM077 | |
| Hair removing cream (Veet) | Reckitt Benckiser , India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma ; US | MHS16 | |
| Heparin sodium salt | Himedia; India | RM554 | |
| Hyaluronidase From Sheep Testes | Sigma ; US | H6254 | |
| I.V. Cannula (Plusflon) | Mediplus, India | Ref 1732411420 | |
| Insulin Syringes | BD ; US | REF 303060 | |
| Isoflurane ( Forane) | Asecia Queenborough | No B506 | Inhalation Anaesthetic |
| Ketamine (Ketamax) | Troikaa Pharmaceuticals Ltd. | Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Meloxicam (Melonex) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Micro needle holders straight & curved | Mercian ; England | BS-13-8 | |
| Micro needle holders straight & curved |
Mercian ; England | BS-13-8 | |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Nylon Thread | Mighty ; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Refresh Tears/Eyemist Gel | Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India | P3060 | No specific Catalog Number |
| RPMI | Himedia; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scalpel | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scissors | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation ; US | No specific Catalog Number | |
| Sucrose | Sigma ; US | S0389 | |
| Surgical Blade No. 22 | La Medcare, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical Board | Locally made | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical White Tape | 3M India ; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Sutures | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| Syringes (1ml, 26 G) | Dispo Van; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Trimmer (Clipper) | Philips | NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005 | |
| Weighing Machine | Braun | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| William's E Media | Himedia; India | AT125 | |
| Xylazine (Xylaxin) | Indian Immunologicals Limited | Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant |
Referências
- Choi, Y., et al. Studying cancer immunotherapy using patient-derived xenografts (PDXs) in humanized mice. Experimental and Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).
- Sutherland, C., et al. Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis. J Vis Exp. (136), e57576 (2018).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).
- Claybon, A., Bishop, A. J. Dissection of a mouse eye for a whole mount of the retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (48), e2563 (2011).
- Steven, P., et al. Experimental induction and three-dimensional two-photon imaging of conjunctiva-associated lymphoid tissue. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (4), 1512-1517 (2008).
- Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo. Journal of Visualized Experiments. (77), e50546 (2013).
- Ullmann, J. F., Moore, B. A., Temple, S. E., Fernandez-Juricic, E., Collin, S. P. The retinal wholemount technique: A window to understanding the brain and behaviour. Brain, Behavior and Evolution. 79 (1), 26-44 (2012).
- Nakao, S., Hafezi-Moghadam, A., Ishibashi, T. Lymphatics and lymphangiogenesis in the eye. Journal of Ophthalmology. 2012, 783163 (2012).
- Mishra, A., et al. Peripheral blood-derived monocytes show neuronal properties and integration in immune-deficient rd1 mouse model upon phenotypic differentiation and induction with retinal growth factors. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 412 (2020).
