Kvantifiering av den antifungala aktiviteten hos peptider mot Candida albicans
Summary
Detta protokoll beskriver en metod för att erhålla kvantitativa data om den antifungala aktiviteten hos peptider och andra föreningar, såsom småmolekylära svampdödande medel, mot Candida albicans. Dess användning av optisk densitet snarare än att räkna kolonibildande enheter för att kvantifiera tillväxthämning sparar tid och resurser.
Abstract
Traditionella metoder för att utföra svampdödande känslighetstestning för Candida albicans är tidskrävande och saknar kvantitativa resultat. Till exempel bygger ett vanligt tillvägagångssätt på pläteringsceller behandlade med olika koncentrationer av svampdödande molekyler på agarplattor och sedan räknar kolonierna för att bestämma förhållandet mellan molekylkoncentration och tillväxthämning. Denna metod kräver många plattor och betydande tid att räkna kolonierna. Ett annat vanligt tillvägagångssätt eliminerar plattorna och räkningen av kolonier genom att visuellt inspektera kulturer behandlade med svampdödande medel för att identifiera den minsta koncentration som krävs för att hämma tillväxten. Visuell inspektion ger emellertid endast kvalitativa resultat, och information om tillväxt vid subhämmande koncentrationer går förlorad. Detta protokoll beskriver en metod för att mäta känsligheten hos C. albicans för svampdödande peptider. Genom att förlita sig på optiska densitetsmätningar av kulturer minskar metoden den tid och material som behövs för att erhålla kvantitativa resultat på odlingstillväxt vid olika peptidkoncentrationer. Inkubationen av svampen med peptider utförs i en 96-brunnsplatta med användning av en lämplig buffert, med kontroller som representerar ingen tillväxthämning och fullständig tillväxthämning. Efter inkubationen med peptiden späds de resulterande cellsuspensionerna för att minska peptidaktiviteten och odlas sedan över natten. Efter tillväxt över natten mäts den optiska densiteten hos varje brunn och jämförs med de positiva och negativa kontrollerna för att beräkna den resulterande tillväxthämningen vid varje peptidkoncentration. Resultaten som använder denna analys är jämförbara med resultaten med den traditionella metoden att plätera kulturerna på agarplattor, men detta protokoll minskar plastavfall och den tid som spenderas på att räkna kolonier. Även om tillämpningarna av detta protokoll har fokuserat på svampdödande peptider, kommer metoden också att vara tillämplig för att testa andra molekyler med känd eller misstänkt svampdödande aktivitet.
Introduction
Candida albicans är medlem i den mänskliga mikrobioten som koloniserar många platser, inklusive munhålan, huden, mag-tarmkanalen och vagina1. För patienter som är immunsupprimerade på grund av sjukdomar som humant immunbristvirus (HIV) och immunsuppressiva behandlingar kan kolonisering av C. albicans leda till lokal eller systemisk candidiasis 2,3. Användningen av för närvarande tillgängliga småmolekylära antimykotiska läkemedel, såsom amfotericin B, azoler eller echinocandiner, kan kompliceras av löslighets- och toxicitetsproblem och av infektionernas resistens mot terapierna 4,5. På grund av begränsningarna hos nuvarande svampdödande medel, forskare söker kontinuerligt efter nya svampdödande molekyler med aktivitet mot C. albicans.
Antimikrobiella peptider (AMP) är ett potentiellt alternativ till de nuvarande småmolekylära antifungala medlen 6,7,8 och föreslås vara mindre mottagliga för resistensutveckling jämfört med småmolekylära läkemedel 9. AMPs är en mångsidig uppsättning peptider, men de är ofta katjoniska, med ett brett spektrum av aktivitet10,11,12. AMPs med aktivitet mot C. albicans inkluderar välkända peptider från histatin- och cecropinfamiljerna 13,14,15, tillsammans med nyligen beskrivna peptider som ToAP2, NDBP-5.7 och histatin 5-varianten K11R-K17R16,17. På grund av deras potential för behandling av Candida-infektioner är identifiering och design av nya AMPs som riktar sig mot C. albicans ett viktigt mål för många forskargrupper.
Som en del av processen för att utveckla effektiva AMPs (och andra svampdödande medel) som riktar sig mot C. albicans, in vitro-testning används ofta för att identifiera lovande peptider. Metoder för att testa svampdödande aktivitet mot C. albicans involverar vanligtvis inkubation av celler med seriella utspädningar av AMP (i buffert eller medium) i 96-brunnsplattor. Flera metoder finns tillgängliga för att bedöma den svampdödande aktiviteten efter inkubation. En teknik som beskrivs av Clinical Laboratory Standards Institute använder en rent visuell bedömning av brunnarnas grumlighet för att bestämma minimikoncentrationen (MIC) för fullständig tillväxthämning (minst 50% hämning för utvalda antifungala medel, som azoler och echinocandiner) och ger ingen kvantifiering av tillväxt vid sub-MIC-koncentrationer18 . Ett annat vanligt tillvägagångssätt innefattar kvantifiering av livskraften efter inkubation med AMP genom plätering av innehållet i brunnarna på agarplattor, inkubering av plattorna och sedan räkning av antalet kolonibildande enheter (CFU) på plattan. Denna metod har använts för att utvärdera ett antal peptider, inklusive histatin 5-baserade peptider, LL-37 och humant laktoferrin 19,20,21. Denna teknik kräver en relativt stor volym agar och ett stort antal plattor och innebär tråkig räkning av CFUs på plattorna. För att få mer kvantitativa data samtidigt som man genererar mindre plastavfall och undviker att räkna CFU, kan innehållet i brunnarna användas för att inokulera färskt medium i en annan 96-brunnsplatta. Efter inkubation av den nyligen inokulerade plattan kan tillväxten kvantifieras genom mätning av den optiska densiteten vid 600 nm (OD600) på en absorbansplattläsare. Denna metod har använts för att bestämma den antifungala aktiviteten hos histatin 5 och dess nedbrytningsfragment och cellpenetrerande peptider 17,22,23,24,25.
Detta protokoll beskriver hur man testar den antifungala aktiviteten hos peptider och använder OD600-metoden för att kvantifiera minskningen av livskraften hos C. albicans på grund av peptider.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll beskriver ett effektivt tillvägagångssätt för att erhålla kvantitativa data om den antifungala aktiviteten hos AMPs mot svamppatogenen C. albicans. Ett vanligt alternativt tillvägagångssätt för att testa peptider och andra svampdödande medel är buljongmikroutspädningen som beskrivs i Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) standard M2718, men denna standard fokuserar på att erhålla kvalitativa visuella resultat istället för kvantitativa resultat. Ett…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (R03DE029270, T32AI089621B), National Science Foundation (CBET 1511718), Department of Education (GAANN-P200A180093) och ett University of Maryland Cross-Campus Seed Grant.
Materials
| 96-well plates (round bottom) | VWR | 10062-902 | |
| Absorbance microplate reader | N/A | N/A | Any available microplate reader is sufficient |
| C. albicans strain SC5314 | ATCC | MYA-2876 | Outro C. albicans may also be used |
| Hemocytometer | N/A | N/A | Can be used to make a standard curve relating cell number to OD600 |
| Microplate shaker | VWR | 2620-926 | |
| Peptide(s) | N/A | N/A | Peptides can be commercially synthesized by any reliable vendor; a purity of ≥95% and trifluoroacetic acid salt removal to hydrochloride salt are recommended |
| Reagent reservoirs for multichannel pipettors | VWR | 18900-320 | Simplifies pipetting into multiwell plates with multichannel pipettor |
| Sodium phosphate, dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | For making NaPB |
| Sodium phosphate, monobasic | Fisher Scientific | BP329-500 | For making NaPB |
| UV spectrophotometer | N/A | N/A | Any available UV spectrophotometer is sufficient |
| YPD medium powder | BD Life Sciences | 242820 | May also be made from yeast extract, peptone, and dextrose |
Referências
- Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: Development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
- Arya, N. R., Rafiq, N. B. Candidiasis. StatPearls. , (2021).
- de Oliveira Santos, G. C., et al. Candida infections and therapeutic strategies: Mechanisms of action for traditional and alternative agents. Frontiers in Microbiology. 9, 1351 (2018).
- Espinel-Ingroff, A. Mechanisms of resistance to antifungal agents: Yeasts and filamentous fungi. Revista Iberoamericana de Micología. 25 (2), 101-106 (2008).
- Wang, X., et al. Delivery strategies of amphotericin B for invasive fungal infections. Acta Pharmaceutica Sinica B. 11 (8), 2585-2604 (2021).
- Struyfs, C., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. Membrane-interacting antifungal peptides. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 649875 (2021).
- Huan, Y., Kong, Q., Mou, H., Yi, H. Antimicrobial peptides: Classification, design, application and research progress in multiple fields. Frontiers in Microbiology. 11, 582779 (2020).
- Sarkar, T., Chetia, M., Chatterjee, S. Antimicrobial peptides and proteins: From nature’s reservoir to the laboratory and beyond. Frontiers in Chemistry. 9, 691532 (2021).
- Mahlapuu, M., Bjorn, C., Ekblom, J. Antimicrobial peptides as therapeutic agents: Opportunities and challenges. Critical Reviews in Biotechnology. 40 (7), 978-992 (2020).
- Lei, J., et al. The antimicrobial peptides and their potential clinical applications. American Journal of Translational Research. 11 (7), 3919-3931 (2019).
- Mercer, D. K., O’Neil, D. A. Innate inspiration: Antifungal peptides and other immunotherapeutics from the host immune response. Frontiers in Immunology. 11, 2177 (2020).
- Bin Hafeez, A., Jiang, X., Bergen, P. J., Zhu, Y. Antimicrobial peptides: An update on classifications and databases. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11691 (2021).
- Xu, T., Levitz, S. M., Diamond, R. D., Oppenheim, F. G. Anticandidal activity of major human salivary histatins. Infection and Immunity. 59 (8), 2549-2554 (1991).
- Helmerhorst, E. J., et al. Amphotericin B- and fluconazole-resistant Candida spp., Aspergillus fumigatus, and other newly emerging pathogenic fungi are susceptible to basic antifungal peptides. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (3), 702-704 (1999).
- Andra, J., Berninghausen, O., Leippe, M. Cecropins, antibacterial peptides from insects and mammals, are potently fungicidal against Candida albicans. Medical Microbiology and Immunology. 189, 169-173 (2001).
- do Nascimento Dias, J., et al. Mechanisms of action of antimicrobial peptides ToAP2 and NDBP-5.7 against Candida albicans planktonic and biofilm cells. Scientific Reports. 10, 10327 (2020).
- Ikonomova, S. P., et al. Effects of histatin 5 modifications on antifungal activity and kinetics of proteolysis. Protein Science. 29, 480-493 (2020).
- Clinical Laboratory Standards Institute. . M27-A3. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts; Approved standard – Third edition. , (2008).
- Lupetti, A., et al. Candidacidal activities of human lactoferrin peptides derived from the N terminus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44 (12), 3257-3263 (2000).
- Han, J., Jyoti, M. A., Song, H. Y., Jang, W. S. Antifungal activity and action mechanism of histatin 5-halocidin hybrid peptides against Candida ssp. PLoS One. 11 (2), 0150196 (2016).
- den Hertog, A. L., et al. Candidacidal effects of two antimicrobial peptides: histatin 5 causes small membrane defects, but LL-37 causes massive disruption of the cell membrane. Biochemical Journal. 388, 689-695 (2005).
- Ikonomova, S. P., Moghaddam-Taaheri, P., Jabra-Rizk, M. A., Wang, Y., Karlsson, A. J. Engineering improved variants of the antifungal peptide histatin 5 with reduced susceptibility to Candida albicans secreted aspartic proteases and enhanced antimicrobial potency. The FEBS Journal. 285 (1), 146-159 (2018).
- Moghaddam-Taaheri, P., Leissa, J. A., Eppler, H. B., Jewell, C. M., Karlsson, A. J. Histatin 5 variant reduces Candida albicans biofilm viability and inhibits biofilm formation. Fungal Genetics and Biology. 149, 103529 (2021).
- Gong, Z., Doolin, M. T., Adhikari, S., Stroka, K. M., Karlsson, A. J. Role of charge and hydrophobicity in translocation of cell-penetrating peptides into Candida albicans cells. AIChE Journal. 65 (12), 16768 (2019).
- Gong, Z., Karlsson, A. J. Translocation of cell-penetrating peptides into Candida fungal pathogens. Protein Science. 26 (9), 1714-1725 (2017).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Fourth edition. 3, (2012).
- Consolidated Sterilizer Systems. Laboratory and Research Autoclaves Available from: https://consteril.com/wp-content/uploads/2020/12/CSS-Product-Brochure.pdf (2022)
- Rodriguez-Tudela, J. L., Cuenca-Estrella, M., Diaz-Guerra, T. M., Mellado, E. Standardization of antifungal susceptibility variables for a semiautomated methodology. Journal of Clinical Microbiology. 39 (7), 2513-2517 (2001).
- Mbuayama, K. R., Taute, H., Strmstedt, A. A., Bester, M. J., Gaspar, A. R. M. Antifungal activity and mode of action of synthetic peptides derived from the tick OsDef2 defensin. Journal of Peptide Science. 28 (5), 3383 (2022).
- Rossignol, T., Kelly, B., Dobson, C., d’Enfert, C. Endocytosis-mediated vacuolar accumulation of the human ApoE apolipoprotein-derived ApoEdpL-W antimicrobial peptide contributes to its antifungal activity in Candida albicans. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (10), 4670-4681 (2011).
- Helmerhorst, E. J., Reijnders, I. M., van’t Hof, W., Veerman, E. C., Nieuw Amerongen, A. V. A critical comparison of the hemolytic and fungicidal activities of cationic antimicrobial peptides. FEBS Letters. 449 (2-3), 105-110 (1999).
- Kerenga, B. K., et al. Salt-tolerant antifungal and antibacterial activities of the corn defensin ZmD32. Frontiers in Microbiology. 10, 795 (2019).
- Lee, I. H., Cho, Y., Lehrer, R. I. Effects of pH and salinity on the antimicrobial properties of clavanins. Infection and Immunity. 65 (7), 2898-2903 (1997).
- Li, X. S., Reddy, M. S., Baev, D., Edgerton, M. Candida albicans Ssa1/2p is the cell envelope binding protein for human salivary histatin 5. Journal of Biological Chemistry. 278 (31), 28553-28561 (2003).
- Rothstein, D. M., et al. Anticandida activity is retained in P-113, a 12-amino-acid fragment of histatin 5. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (5), 1367-1373 (2001).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: Volume transfers with serological pipettes and micropipettors. Journal of Visualized Experiments. (63), e2754 (2012).
- Mansoury, M., Hamed, M., Karmustaji, R., Al Hannan, F., Safrany, S. T. The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates. Biochemistry and Biophysics Report. 26, 100987 (2021).
- Goughenour, K. D., Balada-Llasat, J. M., Rappleye, C. A. Quantitative microplate-based growth assay for determination of antifungal susceptibility of Histoplasma capsulatum yeasts. Journal of Clinical Microbiology. 53 (10), 3286-3295 (2015).
