Quantificare l'attività antifungina dei peptidi contro la Candida albicans
Summary
Questo protocollo descrive un metodo per ottenere dati quantitativi sull’attività antifungina di peptidi e altri composti, come agenti antifungini a piccole molecole, contro la Candida albicans. Il suo uso della densità ottica piuttosto che contare le unità formanti colonie per quantificare l’inibizione della crescita consente di risparmiare tempo e risorse.
Abstract
I metodi tradizionali per eseguire test di sensibilità antifungina per Candida albicans richiedono molto tempo e mancano di risultati quantitativi. Ad esempio, un approccio comune si basa sulla placcatura delle cellule trattate con diverse concentrazioni di molecole antifungine su piastre di agar e quindi sul conteggio delle colonie per determinare la relazione tra concentrazione molecolare e inibizione della crescita. Questo metodo richiede molte piastre e un tempo considerevole per contare le colonie. Un altro approccio comune elimina le piastre e il conteggio delle colonie ispezionando visivamente le colture trattate con agenti antifungini per identificare la concentrazione minima richiesta per inibire la crescita; Tuttavia, l’ispezione visiva produce solo risultati qualitativi e le informazioni sulla crescita a concentrazioni subinibitorie vengono perse. Questo protocollo descrive un metodo per misurare la suscettibilità di C. albicans ai peptidi antifungini. Basandosi su misurazioni della densità ottica delle colture, il metodo riduce il tempo e i materiali necessari per ottenere risultati quantitativi sulla crescita delle colture a diverse concentrazioni peptidiche. L’incubazione del fungo con peptidi viene eseguita in una piastra a 96 pozzetti utilizzando un tampone appropriato, con controlli che rappresentano nessuna inibizione della crescita e completa inibizione della crescita. Dopo l’incubazione con il peptide, le sospensioni cellulari risultanti vengono diluite per ridurre l’attività del peptide e quindi coltivate durante la notte. Dopo la crescita durante la notte, la densità ottica di ciascun pozzetto viene misurata e confrontata con i controlli positivi e negativi per calcolare l’inibizione della crescita risultante a ciascuna concentrazione di peptidi. I risultati che utilizzano questo test sono paragonabili ai risultati che utilizzano il metodo tradizionale di placcatura delle colture su piastre di agar, ma questo protocollo riduce i rifiuti di plastica e il tempo speso per contare le colonie. Sebbene le applicazioni di questo protocollo si siano concentrate sui peptidi antifungini, il metodo sarà applicabile anche alla sperimentazione di altre molecole con attività antifungina nota o sospetta.
Introduction
Candida albicans è un membro del microbiota umano che colonizza numerose località, tra cui la cavità orale, la pelle, il tratto gastrointestinale e la vagina1. Per i pazienti immunocompromessi a causa di malattie come il virus dell’immunodeficienza umana (HIV) e trattamenti immunosoppressivi, la colonizzazione di C. albicans può portare a candidosi locale o sistemica 2,3. L’uso di terapie antifungine a piccole molecole attualmente disponibili, come amfotericina B, azoli o echinocandine, può essere complicato da problemi di solubilità e tossicità e dalla resistenza delle infezioni alle terapie 4,5. A causa dei limiti degli attuali agenti antifungini, i ricercatori sono continuamente alla ricerca di nuove molecole antifungine con attività contro C. albicans.
I peptidi antimicrobici (AMP) sono una potenziale alternativa agli attuali agenti antifungini a piccole molecole 6,7,8 e si propone che siano meno suscettibili allo sviluppo di resistenza rispetto ai farmaci a piccole molecole 9. Gli AMP sono un insieme diversificato di peptidi, ma sono spesso cationici, con un ampio spettro di attività10,11,12. Gli AMP con attività contro C. albicans includono peptidi ben noti delle famiglie di istatina e cecropina 13,14,15, insieme a peptidi descritti più recentemente come ToAP2, NDBP-5.7 e la variante dell’istatina 5 K11R-K17R16,17. A causa del loro potenziale per il trattamento delle infezioni da Candida, identificare e progettare nuovi AMP che colpiscono C. albicans è un obiettivo importante per molti gruppi di ricerca.
Come parte del processo per sviluppare AMP efficaci (e altri agenti antifungini) che colpiscono C. albicans, i test in vitro sono comunemente usati per identificare peptidi promettenti. I metodi per testare l’attività antifungina contro C. albicans implicano tipicamente l’incubazione di cellule con diluizioni seriali degli AMP (in tampone o mezzo) in piastre a 96 pozzetti. Sono disponibili diversi metodi per valutare l’attività antifungina dopo l’incubazione. Una tecnica descritta dal Clinical Laboratory Standards Institute utilizza una valutazione puramente visiva della torbidità dei pozzetti per determinare la concentrazione minima (MIC) per la completa inibizione della crescita (almeno il 50% di inibizione per agenti antifungini selezionati, come azoli ed echinocandine) e non fornisce alcuna quantificazione della crescita a concentrazioni sub-MIC18 . Un altro approccio comunemente usato consiste nel quantificare la vitalità dopo l’incubazione con AMP placcando il contenuto dei pozzetti su piastre di agar, incubando le piastre e quindi contando il numero di unità formanti colonie (CFU) sulla piastra. Questo metodo è stato utilizzato per valutare un certo numero di peptidi, tra cui peptidi a base di istatina 5, LL-37 e lattoferrina umana 19,20,21. Questa tecnica richiede un volume relativamente grande di agar e un numero elevato di piastre e comporta il noioso conteggio dei CFU sulle piastre. Per ottenere più dati quantitativi generando meno rifiuti di plastica ed evitando il conteggio dei CFU, il contenuto dei pozzi può essere utilizzato per inoculare il terreno fresco in un’altra piastra da 96 pozzetti. Dopo aver incubato la piastra appena inoculata, la crescita può essere quantificata misurando la densità ottica a 600 nm (OD600) su un lettore di piastre di assorbanza. Questo metodo è stato utilizzato per determinare l’attività antifungina dell’istatina 5 e dei suoi frammenti di degradazione e peptidi penetranti nelle cellule 17,22,23,24,25.
Questo protocollo descrive come testare l’attività antifungina dei peptidi e utilizza il metodo OD600 per quantificare la riduzione della vitalità di C. albicans dovuta ai peptidi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive un approccio efficiente per ottenere dati quantitativi sull’attività antifungina degli AMP contro il patogeno fungino C. albicans. Un approccio alternativo comune per testare peptidi e altri agenti antifungini è la microdiluizione del brodo descritta nello standard M2718 del Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI), ma questo standard si concentra sull’ottenimento di risultati visivi qualitativi anziché quantitativi. Un altro approccio alternativo è qu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (R03DE029270, T32AI089621B), dalla National Science Foundation (CBET 1511718), dal Dipartimento dell’Istruzione (GAANN-P200A180093) e da un Cross Campus Seed Grant dell’Università del Maryland.
Materials
| 96-well plates (round bottom) | VWR | 10062-902 | |
| Absorbance microplate reader | N/A | N/A | Any available microplate reader is sufficient |
| C. albicans strain SC5314 | ATCC | MYA-2876 | Outro C. albicans may also be used |
| Hemocytometer | N/A | N/A | Can be used to make a standard curve relating cell number to OD600 |
| Microplate shaker | VWR | 2620-926 | |
| Peptide(s) | N/A | N/A | Peptides can be commercially synthesized by any reliable vendor; a purity of ≥95% and trifluoroacetic acid salt removal to hydrochloride salt are recommended |
| Reagent reservoirs for multichannel pipettors | VWR | 18900-320 | Simplifies pipetting into multiwell plates with multichannel pipettor |
| Sodium phosphate, dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | For making NaPB |
| Sodium phosphate, monobasic | Fisher Scientific | BP329-500 | For making NaPB |
| UV spectrophotometer | N/A | N/A | Any available UV spectrophotometer is sufficient |
| YPD medium powder | BD Life Sciences | 242820 | May also be made from yeast extract, peptone, and dextrose |
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