Kvantificering af peptiders svampedræbende aktivitet mod Candida albicans

Summary

Denne protokol beskriver en metode til opnåelse af kvantitative data om antifungal aktivitet af peptider og andre forbindelser, såsom småmolekylære svampedræbende midler, mod Candida albicans. Dens brug af optisk densitet i stedet for at tælle kolonidannende enheder til kvantificering af væksthæmning sparer tid og ressourcer.

Abstract

Traditionelle metoder til udførelse af svampedræbende modtagelighedstest for Candida albicans er tidskrævende og mangler kvantitative resultater. For eksempel er en fælles tilgang afhængig af plettering af celler behandlet med forskellige koncentrationer af svampedræbende molekyler på agarplader og derefter tælle kolonierne for at bestemme forholdet mellem molekylekoncentration og væksthæmning. Denne metode kræver mange plader og betydelig tid til at tælle kolonierne. En anden almindelig tilgang eliminerer pladerne og tællingen af kolonier ved visuelt at inspicere kulturer behandlet med svampedræbende midler for at identificere den minimumskoncentration, der kræves for at hæmme væksten; Imidlertid giver visuel inspektion kun kvalitative resultater, og information om vækst ved subhæmmende koncentrationer går tabt. Denne protokol beskriver en metode til måling af C. albicans modtagelighed for svampedræbende peptider. Ved at stole på optiske densitetsmålinger af kulturer reducerer metoden den tid og de materialer, der er nødvendige for at opnå kvantitative resultater på kulturvækst ved forskellige peptidkoncentrationer. Inkubationen af svampen med peptider udføres i en 96-brøndplade under anvendelse af en passende buffer, hvor kontroller ikke repræsenterer væksthæmning og fuldstændig væksthæmning. Efter inkubationen med peptidet fortyndes de resulterende cellesuspensioner for at reducere peptidaktiviteten og dyrkes derefter natten over. Efter vækst natten over måles den optiske tæthed af hver brønd og sammenlignes med de positive og negative kontroller for at beregne den resulterende væksthæmning ved hver peptidkoncentration. Resultaterne ved hjælp af dette assay er sammenlignelige med resultaterne ved hjælp af den traditionelle metode til plettering af kulturerne på agarplader, men denne protokol reducerer plastaffald og den tid, der bruges på at tælle kolonier. Selvom anvendelserne af denne protokol har fokuseret på svampedræbende peptider, vil metoden også være anvendelig til test af andre molekyler med kendt eller mistænkt svampedræbende aktivitet.

Introduction

Candida albicans er medlem af den menneskelige mikrobiota, der koloniserer adskillige steder, herunder mundhulen, huden, mave-tarmkanalen og vagina¹. For patienter, der er immunkompromitterede på grund af sygdomme som human immundefektvirus (HIV) og immunsuppressive behandlinger, kan koloniseringen af C. albicans føre til lokal eller systemisk candidiasis ^2,3. Anvendelsen af aktuelt tilgængelige småmolekylære svampedræbende midler, såsom amphotericin B, azoler eller echinocandiner, kan kompliceres af opløseligheds- og toksicitetsproblemer og af infektioners resistens over for terapeutiske^{midler 4,5}. På grund af begrænsningerne i de nuværende svampedræbende midler søger forskere løbende efter nye svampedræbende molekyler med aktivitet mod C. albicans.

Antimikrobielle peptider (AMP’er) er et potentielt alternativ til de nuværende småmolekylære svampemidler ^6,7,8 og foreslås at være mindre modtagelige for udvikling af resistens sammenlignet med småmolekylære lægemidler 9. AMP’er er et forskelligartet sæt peptider, men de er ofte kationiske med et bredt spektrum af aktivitet^10,11,12. AMP’er med aktivitet mod C. albicans omfatter velkendte peptider fra histatin- og cecropinfamilierne 13,14,15 sammen med nyere beskrevne peptider som ToAP2, NDBP-5.7 og histatin 5-varianten K11R-K17R ^16,17. På grund af deres potentiale til behandling af Candida-infektioner er identifikation og design af nye AMP’er, der er målrettet mod C. albicans, et vigtigt mål for mange forskningsgrupper.

Som en del af processen med at udvikle effektive AMP’er (og andre svampedræbende midler), der er målrettet mod C. albicans, anvendes in vitro-test almindeligvis til at identificere lovende peptider. Metoder til test af svampedræbende aktivitet mod C. albicans involverer typisk inkubation af celler med serielle fortyndinger af AMP’erne (i buffer eller medium) i 96-brøndplader. Der findes flere metoder til vurdering af svampedræbende aktivitet efter inkubation. En teknik beskrevet af Clinical Laboratory Standards Institute anvender en rent visuel vurdering af brøndenes turbiditet til at bestemme minimumskoncentrationen (MIC) for fuldstændig hæmning af væksten (mindst 50 % hæmning for udvalgte svampedræbende midler som azoler og echinocandiner) og giver ingen kvantificering af væksten ved subMIC-koncentrationer¹⁸ . En anden almindeligt anvendt fremgangsmåde indebærer kvantificering af levedygtigheden efter inkubation med AMP’er ved at plettere indholdet af brøndene på agarplader, inkubere pladerne og derefter tælle antallet af kolonidannende enheder (CFU’er) på pladen. Denne metode er blevet anvendt til evaluering af en række peptider, herunder histatin 5-baserede peptider, LL-37 og humant lactoferrin 19,20,21. Denne teknik kræver et relativt stort volumen agar og et stort antal plader og involverer kedelig optælling af CFU’er på pladerne. For at opnå mere kvantitative data og samtidig generere mindre plastaffald og undgå at tælle CFU’er, kan indholdet af brøndene bruges til at inokulere frisk medium i en anden 96-brøndplade. Efter inkubation af den nyligt podede plade kan væksten kvantificeres ved måling af den optiske densitet ved 600 nm (OD₆₀₀) på en absorbanspladelæser. Denne metode er blevet anvendt til at bestemme den svampedræbende aktivitet af histatin 5 og dets nedbrydningsfragmenter og cellepenetrerende peptider 17,22,23,24,25.

Denne protokol beskriver, hvordan man tester peptiders svampedræbende aktivitet og bruger OD_600-metoden til at kvantificere reduktionen i levedygtighed af C. albicans på grund af peptider.

Protocol

Der blev opnået godkendelse fra University of Maryland, College Park, Institutional Biosafety Committee (IBC) til arbejdet med C. albicans i denne protokol (PN 274). C. albicans-stammen SC5314 (se materialetabel) blev anvendt i denne undersøgelse; Der kan dog også anvendes enhver anden stamme. 1. Fremstilling af buffer, sterilt vand og dyrkningsmedium Der fremstilles steril 0,1 M natriumphosphatbuffer (NaPB)26</…

Representative Results

Brug af OD600-målinger til at kvantificere reduktionen i vækst på grund af svampedræbende peptider sparer betydelig tid sammenlignet med plettering af prøver og tælling af CFU’er. Metoden beskrevet i denne protokol kræver, at trinene udføres på tre forskellige dage. På den første dag er ca. 1 time nødvendig for at forberede buffere og medier (ikke inklusive steriliseringstiden) og inokulere startkulturen af C. albicans til inkubation natten over. På den anden dag kræver trinene 5-6 timer…

Discussion

Denne protokol beskriver en effektiv tilgang til opnåelse af kvantitative data om AMPs svampedræbende aktivitet mod svampepatogenet C. albicans. En almindelig alternativ tilgang til test af peptider og andre svampedræbende midler er bouillonmikrofortyndingen beskrevet i Clinical Laboratory Standards Institute’s (CLSI) standard M27¹⁸, men denne standard fokuserer på at opnå kvalitative visuelle resultater i stedet for kvantitative resultater. En anden alternativ tilgang er at anvende …

Materials

96-well plates (round bottom)	VWR	10062-902
Absorbance microplate reader	N/A	N/A	Any available microplate reader is sufficient
C. albicans strain SC5314	ATCC	MYA-2876	Outro C. albicans may also be used
Hemocytometer	N/A	N/A	Can be used to make a standard curve relating cell number to OD600
Microplate shaker	VWR	2620-926
Peptide(s)	N/A	N/A	Peptides can be commercially synthesized by any reliable vendor; a purity of ≥95% and trifluoroacetic acid salt removal to hydrochloride salt are recommended
Reagent reservoirs for multichannel pipettors	VWR	18900-320	Simplifies pipetting into multiwell plates with multichannel pipettor
Sodium phosphate, dibasic	Fisher Scientific	BP332-500	For making NaPB
Sodium phosphate, monobasic	Fisher Scientific	BP329-500	For making NaPB
UV spectrophotometer	N/A	N/A	Any available UV spectrophotometer is sufficient
YPD medium powder	BD Life Sciences	242820	May also be made from yeast extract, peptone, and dextrose