פרוטוקול זה מתאר שיטה לקבלת נתונים כמותיים על הפעילות האנטי-פטרייתית של פפטידים ותרכובות אחרות, כגון חומרים אנטי-פטרייתיים בעלי מולקולות קטנות, כנגד קנדידה אלביקנס. השימוש בו בצפיפות אופטית במקום לספור יחידות יוצרות מושבה כדי לכמת עיכוב גדילה חוסך זמן ומשאבים.
שיטות מסורתיות לביצוע בדיקות רגישות אנטי פטרייתיות לקנדידה אלביקנס גוזלות זמן רב וחסרות תוצאות כמותיות. לדוגמה, גישה נפוצה מסתמכת על ציפוי תאים המטופלים בריכוזים שונים של מולקולות אנטי פטרייתיות על לוחות אגר ולאחר מכן ספירת המושבות כדי לקבוע את הקשר בין ריכוז מולקולות ועיכוב גדילה. שיטה זו דורשת לוחות רבים וזמן ניכר לספירת המושבות. גישה נפוצה נוספת מבטלת את הצלחות ואת ספירת המושבות על ידי בדיקה חזותית של תרבויות שטופלו בחומרים אנטי פטרייתיים כדי לזהות את הריכוז המינימלי הדרוש לעיכוב הצמיחה; עם זאת, בדיקה חזותית מניבה תוצאות איכותיות בלבד, ומידע על גדילה בריכוזים תת-מעכבים הולך לאיבוד. פרוטוקול זה מתאר שיטה למדידת הרגישות של C. albicans לפפטידים אנטי פטרייתיים. על ידי הסתמכות על מדידות צפיפות אופטיות של תרביות, השיטה מפחיתה את הזמן והחומרים הדרושים להשגת תוצאות כמותיות על גידול תרביות בריכוזי פפטידים שונים. הדגירה של הפטרייה עם פפטידים מתבצעת בצלחת של 96 בארות באמצעות חיץ מתאים, כאשר בקרות אינן מייצגות עיכוב גדילה ועיכוב גדילה מלא. לאחר הדגירה עם הפפטיד, מתלי התאים המתקבלים מדוללים כדי להפחית את פעילות הפפטיד ואז גדלים בן לילה. לאחר גדילה בין לילה, הצפיפות האופטית של כל באר נמדדת ומושווה לבקרות החיוביות והשליליות כדי לחשב את עיכוב הצמיחה המתקבל בכל ריכוז פפטידים. התוצאות באמצעות בדיקה זו דומות לתוצאות בשיטה המסורתית של ציפוי התרבויות על צלחות אגר, אך פרוטוקול זה מפחית את פסולת הפלסטיק ואת הזמן המושקע בספירת מושבות. למרות שהיישומים של פרוטוקול זה התמקדו בפפטידים אנטי פטרייתיים, השיטה תהיה ישימה גם לבדיקת מולקולות אחרות עם פעילות אנטי פטרייתית ידועה או חשודה.
קנדידה אלביקנס היא חלק מהמיקרוביוטה האנושית שמאכלסת מקומות רבים, כולל חלל הפה, העור, מערכת העיכול והנרתיק1. עבור חולים מדוכאי חיסון עקב מחלות כגון וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) וטיפולים מדכאי חיסון, הנשאות של C. albicans עלולה להוביל לקנדידה מקומית או מערכתית 2,3. השימוש בטיפולים אנטי-פטרייתיים במולקולות קטנות הזמינות כיום, כגון אמפוטריצין B, אזולים או אכינוקנדינים, יכול להיות מסובך על ידי בעיות מסיסות ורעילות ועל ידי עמידות של זיהומים לטיפולים 4,5. בשל המגבלות של חומרים אנטי פטרייתיים הנוכחיים, החוקרים מחפשים ללא הרף מולקולות אנטי פטרייתיות חדשות עם פעילות נגד C. albicans.
פפטידים אנטי-מיקרוביאליים (AMPs) הם חלופה פוטנציאלית לחומרים האנטי-פטרייתיים הנוכחיים של מולקולות קטנות 6,7,8 ומוצעים להיות פחות רגישים להתפתחות עמידות בהשוואה לתרופות בעלות מולקולות קטנות 9. AMPs הם קבוצה מגוונת של פפטידים, אבל הם לעתים קרובות קטיוניים, עם ספקטרום רחב של פעילות10,11,12. AMPs עם פעילות נגד C. albicans כוללים פפטידים ידועים ממשפחות היסטטין וצקרופין 13,14,15, יחד עם פפטידים שתוארו לאחרונה כמו ToAP2, NDBP-5.7, וגרסת היסטטין 5 K11R-K17R 16,17. בשל הפוטנציאל שלהם לטיפול בזיהומי קנדידה, זיהוי ועיצוב AMPs חדשים המכוונים ל– C. albicans הוא יעד חשוב עבור קבוצות מחקר רבות.
כחלק מהתהליך לפיתוח AMPs יעילים (וחומרים אנטי פטרייתיים אחרים) המכוונים ל– C. albicans, בדיקות חוץ גופיות משמשות בדרך כלל לזיהוי פפטידים מבטיחים. שיטות לבדיקת פעילות אנטי-פטרייתית נגד C. albicans כוללות בדרך כלל דגירה של תאים עם דילול סדרתי של AMPs (בחיץ או בתווך) בלוחות 96 בארות. קיימות מספר שיטות להערכת הפעילות האנטי פטרייתית לאחר הדגירה. טכניקה שתוארה על ידי מכון התקנים למעבדה קלינית משתמשת בהערכה חזותית טהורה של עכירות הבארות כדי לקבוע את הריכוז המינימלי (MIC) לעיכוב מוחלט של הצמיחה (עיכוב של לפחות 50% עבור חומרים אנטי פטרייתיים נבחרים, כמו azoles ו echinocandins) ואינה מספקת כימות של צמיחה בריכוזים sub-MIC18 . גישה נפוצה נוספת כוללת כימות הכדאיות לאחר הדגירה עם AMPs על ידי ציפוי תכולת הבארות על לוחות אגר, דגירה על הצלחות, ולאחר מכן ספירת מספר יחידות יוצרות מושבה (CFUs) על הצלחת. שיטה זו שימשה להערכת מספר פפטידים, כולל פפטידים מבוססי היסטטין 5, LL-37, ולקטופריןאנושי 19,20,21. טכניקה זו דורשת נפח גדול יחסית של אגר ומספר גבוה של צלחות וכרוכה בספירה מייגעת של CFUs על הצלחות. כדי לקבל נתונים כמותיים יותר תוך יצירת פחות פסולת פלסטיק והימנעות מספירת CFUs, ניתן להשתמש בתכולת הבארות כדי לחסן מדיום טרי בצלחת נוספת בת 96 בארות. לאחר הדגירה על הצלחת שזה עתה חוסנה, ניתן לכמת את הגידול על ידי מדידת הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר (OD600) בקורא לוחות ספיגה. שיטה זו שימשה לקביעת הפעילות האנטי פטרייתית של היסטטין 5 ומקטעי הפירוק שלו ופפטידים חודרי תאים 17,22,23,24,25.
פרוטוקול זה מתאר כיצד לבדוק את הפעילות האנטי-פטרייתית של פפטידים ומשתמש בשיטת OD600 כדי לכמת את הפחתת הכדאיות של C. albicans עקב פפטידים.
פרוטוקול זה מתאר גישה יעילה לקבלת נתונים כמותיים על הפעילות האנטי פטרייתית של AMPs כנגד הפתוגן הפטרייתי C. albicans. גישה חלופית נפוצה אחת לבדיקת פפטידים וחומרים אנטי פטרייתיים אחרים היא מיקרודילול מרק המתואר בתקן M2718 של מכון התקנים למעבדות קליניות (CLSI), אך תקן זה מתמקד בהשגת תו…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (R03DE029270, T32AI089621B), הקרן הלאומית למדע (CBET 1511718), מחלקת החינוך (GAANN-P200A180093), ומענק זרעים חוצה קמפוסים של אוניברסיטת מרילנד.
96-well plates (round bottom) | VWR | 10062-902 | |
Absorbance microplate reader | N/A | N/A | Any available microplate reader is sufficient |
C. albicans strain SC5314 | ATCC | MYA-2876 | Outro C. albicans may also be used |
Hemocytometer | N/A | N/A | Can be used to make a standard curve relating cell number to OD600 |
Microplate shaker | VWR | 2620-926 | |
Peptide(s) | N/A | N/A | Peptides can be commercially synthesized by any reliable vendor; a purity of ≥95% and trifluoroacetic acid salt removal to hydrochloride salt are recommended |
Reagent reservoirs for multichannel pipettors | VWR | 18900-320 | Simplifies pipetting into multiwell plates with multichannel pipettor |
Sodium phosphate, dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | For making NaPB |
Sodium phosphate, monobasic | Fisher Scientific | BP329-500 | For making NaPB |
UV spectrophotometer | N/A | N/A | Any available UV spectrophotometer is sufficient |
YPD medium powder | BD Life Sciences | 242820 | May also be made from yeast extract, peptone, and dextrose |