Peptitlerin Candida albicans'a Karşı Antifungal Aktivitesinin Ölçülmesi
Summary
Bu protokol, peptitlerin ve küçük moleküllü antifungal ajanlar gibi diğer bileşiklerin Candida albicans’a karşı antifungal aktivitesi hakkında nicel veriler elde etmek için bir yöntemi açıklar. Büyüme inhibisyonunu ölçmek için koloni oluşturan birimleri saymak yerine optik yoğunluk kullanımı, zamandan ve kaynaklardan tasarruf sağlar.
Abstract
Candida albicans için antifungal duyarlılık testi yapmak için geleneksel yöntemler zaman alıcıdır ve nicel sonuçlardan yoksundur. Örneğin, yaygın bir yaklaşım, agar plakaları üzerinde farklı konsantrasyonlarda antifungal moleküllerle muamele edilmiş hücrelerin kaplanmasına ve daha sonra molekül konsantrasyonu ile büyüme inhibisyonu arasındaki ilişkiyi belirlemek için kolonilerin sayılmasına dayanır. Bu yöntem, kolonileri saymak için birçok plaka ve önemli bir zaman gerektirir. Başka bir yaygın yaklaşım, büyümeyi engellemek için gereken minimum konsantrasyonu belirlemek için antifungal ajanlarla muamele edilen kültürleri görsel olarak inceleyerek plakaları ve kolonilerin sayımını ortadan kaldırır; Bununla birlikte, görsel muayene sadece kalitatif sonuçlar üretir ve subinhibitör konsantrasyonlarda büyüme hakkında bilgi kaybolur. Bu protokol, C. albicans’ın antifungal peptitlere duyarlılığını ölçmek için bir yöntem açıklar. Kültürlerin optik yoğunluk ölçümlerine dayanarak, yöntem farklı peptit konsantrasyonlarında kültür büyümesi üzerinde nicel sonuçlar elde etmek için gereken zamanı ve malzemeleri azaltır. Mantarın peptitlerle inkübasyonu, uygun bir tampon kullanılarak 96 delikli bir plakada, büyüme inhibisyonu ve tam büyüme inhibisyonunu temsil etmeyen kontrollerle gerçekleştirilir. Peptit ile inkübasyonu takiben, elde edilen hücre süspansiyonları peptid aktivitesini azaltmak için seyreltilir ve daha sonra gece boyunca büyütülür. Gece boyunca büyümeden sonra, her bir kuyucuğun optik yoğunluğu ölçülür ve her peptid konsantrasyonunda ortaya çıkan büyüme inhibisyonunu hesaplamak için pozitif ve negatif kontrollerle karşılaştırılır. Bu tahlili kullanan sonuçlar, kültürleri agar plakalarına kaplamanın geleneksel yöntemini kullanan sonuçlarla karşılaştırılabilir, ancak bu protokol plastik atıkları ve kolonileri saymak için harcanan zamanı azaltır. Bu protokolün uygulamaları antifungal peptitlere odaklanmış olsa da, yöntem bilinen veya şüphelenilen antifungal aktiviteye sahip diğer moleküllerin test edilmesine de uygulanacaktır.
Introduction
Candida albicans, ağız boşluğu, cilt, gastrointestinal sistem ve vajina1 dahil olmak üzere çok sayıda yeri kolonize eden insan mikrobiyotasının bir üyesidir. İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV) ve immünsüpresif tedaviler gibi hastalıklar nedeniyle bağışıklık sistemi baskılanmış hastalar için, C. albicans’ın kolonizasyonu lokal veya sistemik kandidiyazise yol açabilir 2,3. Amfoterisin B, azoller veya ekinokandinler gibi şu anda mevcut olan küçük moleküllü antifungal terapötiklerin kullanımı, çözünürlük ve toksisite sorunları ve enfeksiyonların terapötiklere direnci ile karmaşık olabilir 4,5. Mevcut antifungal ajanların sınırlamaları nedeniyle, araştırmacılar sürekli olarak C. albicans’a karşı aktiviteye sahip yeni antifungal moleküller aramaktadır.
Antimikrobiyal peptitler (AMP’ler) mevcut küçük moleküllü antifungal ajanlara potansiyel bir alternatiftir 6,7,8 ve küçük moleküllü ilaçlara kıyasla direnç gelişimine daha az duyarlı oldukları öne sürülmektedir 9. AMP’ler çeşitli peptitler kümesidir, ancak genellikle katyoniktirler ve geniş bir aktivite spektrumu10,11,12’dir. C. albicans’a karşı aktivitesi olan AMP’ler, 13,14,15 histatin ve çekropin ailelerinden iyi bilinen peptitlerin yanı sıra ToAP2, NDBP-5.7 ve histatin 5 varyantı K11R-K17R16,17 gibi daha yakın zamanda tanımlanmış peptitleri içerir. Candida enfeksiyonlarını tedavi etme potansiyelleri nedeniyle, C. albicans’ı hedef alan yeni AMP’lerin tanımlanması ve tasarlanması birçok araştırma grubu için önemli bir hedeftir.
C. albicans’ı hedef alan etkili AMP’ler (ve diğer antifungal ajanlar) geliştirme sürecinin bir parçası olarak, in vitro testler umut verici peptitleri tanımlamak için yaygın olarak kullanılır. Antifungal aktiviteyi C. albicans’a karşı test etme yöntemleri tipik olarak 96 delikli plakalarda AMP’lerin seri seyreltilmeleriyle (tampon veya ortamda) hücrelerin inkübe edilmesini içerir. Kuluçka sonrası antifungal aktiviteyi değerlendirmek için çeşitli yöntemler mevcuttur. Klinik Laboratuvar Standartları Enstitüsü tarafından tanımlanan bir teknik, büyümenin tamamen inhibisyonu için minimum konsantrasyonu (MIC) belirlemek için kuyucukların bulanıklığının tamamen görsel bir değerlendirmesini kullanır (azoller ve ekinokandinler gibi seçilmiş antifungal ajanlar için en az% 50 inhibisyon) ve alt MIC konsantrasyonlarında büyümenin nicelleştirilmesini sağlamaz18 . Yaygın olarak kullanılan bir diğer yaklaşım, kuyucukların içeriğini agar plakaları üzerine kaplayarak, plakaları inkübe ederek ve daha sonra plakadaki koloni oluşturan birimlerin (CFU’lar) sayısını sayarak AMP’lerle inkübasyondan sonra canlılığın ölçülmesini içerir. Bu yöntem, histatin 5 bazlı peptitler, LL-37 ve insan laktoferrin 19,20,21 dahil olmak üzere bir dizi peptidi değerlendirmek için kullanılmıştır. Bu teknik, nispeten büyük miktarda agar ve çok sayıda plaka gerektirir ve plakalardaki CFU’ların sıkıcı bir şekilde sayılmasını içerir. Daha az plastik atık üretirken ve CFU’ları saymaktan kaçınırken daha fazla nicel veri elde etmek için, kuyuların içeriği başka bir 96 kuyucuklu plakada taze ortamı aşılamak için kullanılabilir. Yeni aşılanan plakayı inkübe ettikten sonra, bir absorbans plakası okuyucusunda optik yoğunluğu 600 nm’de (OD600) ölçerek büyüme ölçülebilir. Bu yöntem, histatin 5’in antifungal aktivitesini ve bozunma fragmanlarını ve hücre penetran peptitleri 17,22,23,24,25’i belirlemek için kullanılmıştır.
Bu protokol, peptitlerin antifungal aktivitesinin nasıl test edileceğini açıklar ve peptidler nedeniyle C. albicans’ın yaşayabilirliğindeki azalmayı ölçmek için OD600 yöntemini kullanır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, mantar patojeni C. albicans’a karşı AMP’lerin antifungal aktivitesi hakkında nicel veriler elde etmek için etkili bir yaklaşımı açıklamaktadır. Peptitleri ve diğer antifungal ajanları test etmek için yaygın bir alternatif yaklaşım, Klinik Laboratuvar Standartları Enstitüsü’nün (CLSI) standardı M2718’de açıklanan et suyu mikrodilüsyonudur, ancak bu standart nicel sonuçlar yerine nitel görsel sonuçlar elde etmeye odaklanmaktadır. Başka bir alternati…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (R03DE029270, T32AI089621B), Ulusal Bilim Vakfı (CBET 1511718), Eğitim Bakanlığı (GAANN-P200A180093) ve Maryland Üniversitesi Kampüsler Arası Tohum Bursu tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 96-well plates (round bottom) | VWR | 10062-902 | |
| Absorbance microplate reader | N/A | N/A | Any available microplate reader is sufficient |
| C. albicans strain SC5314 | ATCC | MYA-2876 | Outro C. albicans may also be used |
| Hemocytometer | N/A | N/A | Can be used to make a standard curve relating cell number to OD600 |
| Microplate shaker | VWR | 2620-926 | |
| Peptide(s) | N/A | N/A | Peptides can be commercially synthesized by any reliable vendor; a purity of ≥95% and trifluoroacetic acid salt removal to hydrochloride salt are recommended |
| Reagent reservoirs for multichannel pipettors | VWR | 18900-320 | Simplifies pipetting into multiwell plates with multichannel pipettor |
| Sodium phosphate, dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | For making NaPB |
| Sodium phosphate, monobasic | Fisher Scientific | BP329-500 | For making NaPB |
| UV spectrophotometer | N/A | N/A | Any available UV spectrophotometer is sufficient |
| YPD medium powder | BD Life Sciences | 242820 | May also be made from yeast extract, peptone, and dextrose |
Referências
- Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: Development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
- Arya, N. R., Rafiq, N. B. Candidiasis. StatPearls. , (2021).
- de Oliveira Santos, G. C., et al. Candida infections and therapeutic strategies: Mechanisms of action for traditional and alternative agents. Frontiers in Microbiology. 9, 1351 (2018).
- Espinel-Ingroff, A. Mechanisms of resistance to antifungal agents: Yeasts and filamentous fungi. Revista Iberoamericana de Micología. 25 (2), 101-106 (2008).
- Wang, X., et al. Delivery strategies of amphotericin B for invasive fungal infections. Acta Pharmaceutica Sinica B. 11 (8), 2585-2604 (2021).
- Struyfs, C., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. Membrane-interacting antifungal peptides. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 649875 (2021).
- Huan, Y., Kong, Q., Mou, H., Yi, H. Antimicrobial peptides: Classification, design, application and research progress in multiple fields. Frontiers in Microbiology. 11, 582779 (2020).
- Sarkar, T., Chetia, M., Chatterjee, S. Antimicrobial peptides and proteins: From nature’s reservoir to the laboratory and beyond. Frontiers in Chemistry. 9, 691532 (2021).
- Mahlapuu, M., Bjorn, C., Ekblom, J. Antimicrobial peptides as therapeutic agents: Opportunities and challenges. Critical Reviews in Biotechnology. 40 (7), 978-992 (2020).
- Lei, J., et al. The antimicrobial peptides and their potential clinical applications. American Journal of Translational Research. 11 (7), 3919-3931 (2019).
- Mercer, D. K., O’Neil, D. A. Innate inspiration: Antifungal peptides and other immunotherapeutics from the host immune response. Frontiers in Immunology. 11, 2177 (2020).
- Bin Hafeez, A., Jiang, X., Bergen, P. J., Zhu, Y. Antimicrobial peptides: An update on classifications and databases. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11691 (2021).
- Xu, T., Levitz, S. M., Diamond, R. D., Oppenheim, F. G. Anticandidal activity of major human salivary histatins. Infection and Immunity. 59 (8), 2549-2554 (1991).
- Helmerhorst, E. J., et al. Amphotericin B- and fluconazole-resistant Candida spp., Aspergillus fumigatus, and other newly emerging pathogenic fungi are susceptible to basic antifungal peptides. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (3), 702-704 (1999).
- Andra, J., Berninghausen, O., Leippe, M. Cecropins, antibacterial peptides from insects and mammals, are potently fungicidal against Candida albicans. Medical Microbiology and Immunology. 189, 169-173 (2001).
- do Nascimento Dias, J., et al. Mechanisms of action of antimicrobial peptides ToAP2 and NDBP-5.7 against Candida albicans planktonic and biofilm cells. Scientific Reports. 10, 10327 (2020).
- Ikonomova, S. P., et al. Effects of histatin 5 modifications on antifungal activity and kinetics of proteolysis. Protein Science. 29, 480-493 (2020).
- Clinical Laboratory Standards Institute. . M27-A3. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts; Approved standard – Third edition. , (2008).
- Lupetti, A., et al. Candidacidal activities of human lactoferrin peptides derived from the N terminus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44 (12), 3257-3263 (2000).
- Han, J., Jyoti, M. A., Song, H. Y., Jang, W. S. Antifungal activity and action mechanism of histatin 5-halocidin hybrid peptides against Candida ssp. PLoS One. 11 (2), 0150196 (2016).
- den Hertog, A. L., et al. Candidacidal effects of two antimicrobial peptides: histatin 5 causes small membrane defects, but LL-37 causes massive disruption of the cell membrane. Biochemical Journal. 388, 689-695 (2005).
- Ikonomova, S. P., Moghaddam-Taaheri, P., Jabra-Rizk, M. A., Wang, Y., Karlsson, A. J. Engineering improved variants of the antifungal peptide histatin 5 with reduced susceptibility to Candida albicans secreted aspartic proteases and enhanced antimicrobial potency. The FEBS Journal. 285 (1), 146-159 (2018).
- Moghaddam-Taaheri, P., Leissa, J. A., Eppler, H. B., Jewell, C. M., Karlsson, A. J. Histatin 5 variant reduces Candida albicans biofilm viability and inhibits biofilm formation. Fungal Genetics and Biology. 149, 103529 (2021).
- Gong, Z., Doolin, M. T., Adhikari, S., Stroka, K. M., Karlsson, A. J. Role of charge and hydrophobicity in translocation of cell-penetrating peptides into Candida albicans cells. AIChE Journal. 65 (12), 16768 (2019).
- Gong, Z., Karlsson, A. J. Translocation of cell-penetrating peptides into Candida fungal pathogens. Protein Science. 26 (9), 1714-1725 (2017).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Fourth edition. 3, (2012).
- Consolidated Sterilizer Systems. Laboratory and Research Autoclaves Available from: https://consteril.com/wp-content/uploads/2020/12/CSS-Product-Brochure.pdf (2022)
- Rodriguez-Tudela, J. L., Cuenca-Estrella, M., Diaz-Guerra, T. M., Mellado, E. Standardization of antifungal susceptibility variables for a semiautomated methodology. Journal of Clinical Microbiology. 39 (7), 2513-2517 (2001).
- Mbuayama, K. R., Taute, H., Strmstedt, A. A., Bester, M. J., Gaspar, A. R. M. Antifungal activity and mode of action of synthetic peptides derived from the tick OsDef2 defensin. Journal of Peptide Science. 28 (5), 3383 (2022).
- Rossignol, T., Kelly, B., Dobson, C., d’Enfert, C. Endocytosis-mediated vacuolar accumulation of the human ApoE apolipoprotein-derived ApoEdpL-W antimicrobial peptide contributes to its antifungal activity in Candida albicans. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (10), 4670-4681 (2011).
- Helmerhorst, E. J., Reijnders, I. M., van’t Hof, W., Veerman, E. C., Nieuw Amerongen, A. V. A critical comparison of the hemolytic and fungicidal activities of cationic antimicrobial peptides. FEBS Letters. 449 (2-3), 105-110 (1999).
- Kerenga, B. K., et al. Salt-tolerant antifungal and antibacterial activities of the corn defensin ZmD32. Frontiers in Microbiology. 10, 795 (2019).
- Lee, I. H., Cho, Y., Lehrer, R. I. Effects of pH and salinity on the antimicrobial properties of clavanins. Infection and Immunity. 65 (7), 2898-2903 (1997).
- Li, X. S., Reddy, M. S., Baev, D., Edgerton, M. Candida albicans Ssa1/2p is the cell envelope binding protein for human salivary histatin 5. Journal of Biological Chemistry. 278 (31), 28553-28561 (2003).
- Rothstein, D. M., et al. Anticandida activity is retained in P-113, a 12-amino-acid fragment of histatin 5. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (5), 1367-1373 (2001).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: Volume transfers with serological pipettes and micropipettors. Journal of Visualized Experiments. (63), e2754 (2012).
- Mansoury, M., Hamed, M., Karmustaji, R., Al Hannan, F., Safrany, S. T. The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates. Biochemistry and Biophysics Report. 26, 100987 (2021).
- Goughenour, K. D., Balada-Llasat, J. M., Rappleye, C. A. Quantitative microplate-based growth assay for determination of antifungal susceptibility of Histoplasma capsulatum yeasts. Journal of Clinical Microbiology. 53 (10), 3286-3295 (2015).
