Parkinson hastalığının patogenezini incelemek ve anlamak için α-sinükleinin in vivo fizyolojik modeli gereklidir. İnsanlaştırılmış bir maya modeli kullanarak α-sinükleinin sitotoksisitesini ve agrega oluşumunu izlemek için bir yöntem tanımladık.
Parkinson hastalığı ikinci en sık görülen nörodejeneratif hastalıktır ve yanlış katlanmış ve agrega olmuş α-sinüklein içeren Lewy cisimlerinin oluşumunun neden olduğu ilerleyici hücre ölümü ile karakterizedir. α-sinüklein, sinaptik vezikül kaçakçılığını düzenleyen bol miktarda presinaptik bir proteindir, ancak proteinli inklüzyonların birikmesi nörotoksisiteye neden olur. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, bakteriyel şaperonlar da dahil olmak üzere çeşitli genetik faktörlerin, in vitro α-sinüklein agregalarının oluşumunu azaltabileceğini ortaya koymuştur. Bununla birlikte, bunu hastalar için potansiyel bir tedavi olarak uygulamak için hücredeki anti-agregasyon etkisini izlemek de önemlidir. Nöronal hücreleri kullanmak ideal olacaktır, ancak bu hücrelerin ele alınması zordur ve anti-agregasyon fenotipini sergilemek uzun zaman alır. Bu nedenle, in vivo anti-agregasyon aktivitesinin daha fazla değerlendirilmesi için hızlı ve etkili bir in vivo araç gereklidir. Burada açıklanan yöntem, insan α-sinükleini ifade eden insanlaştırılmış maya Saccharomyces cerevisiae’deki anti-agregasyon fenotipini izlemek ve analiz etmek için kullanılmıştır. Bu protokol, α-sinüklein kaynaklı hücresel toksisiteyi ve ayrıca hücrelerde α-sinüklein agregalarının oluşumunu izlemek için kullanılabilecek in vivo araçları göstermektedir.
Parkinson hastalığı (PH) tüm dünyada yaşlanan toplumlar için ciddi bir sorundur. α-sinükleinin agregasyonu PD ile yakından ilişkilidir ve α-sinükleinin protein agregaları, hastalığın teşhisi için moleküler bir biyobelirteç olarak yaygın olarak kullanılmaktadır1. α-sinüklein, N-terminal lipit bağlayıcı α-sarmal, amiloid bağlayıcı merkezi alan (NAC) ve C-terminal asidik kuyruk2 olmak üzere üç alana sahip küçük bir asidik proteindir (140 amino asit uzunluğunda). α-sinükleinin yanlış katlanması kendiliğinden ortaya çıkabilir ve sonunda Lewy cisimleri3 adı verilen amiloid agregalarının oluşumuna yol açar. α-sinüklein, PD’nin patogenezine çeşitli şekillerde katkıda bulunabilir. Genel olarak, protofibriller adı verilen anormal, çözünür oligomerik formlarının, sinaptik fonksiyon3 de dahil olmak üzere çeşitli hücresel hedefleri etkileyerek nöronal hücre ölümüne neden olan toksik türler olduğu düşünülmektedir.
Nörodejeneratif hastalıkları incelemek için kullanılan biyolojik modeller, genomları ve hücresel biyolojileri açısından insanlarla ilgili olmalıdır. En iyi modeller insan nöronal hücre hatları olacaktır. Bununla birlikte, bu hücre hatları, kültürlerin bakımındaki zorluklar, düşük transfeksiyon verimliliği ve yüksek masraf4 gibi çeşitli teknik sorunlarla ilişkilidir. Bu nedenlerle, bu araştırma alanındaki ilerlemeyi hızlandırmak için kolay ve güvenilir bir araç gereklidir. Önemli olarak, toplanan verileri analiz etmek için aracın kullanımı kolay olmalıdır. Bu perspektiflerden, Drosophila, Caenorhabditis elegans, Danio rerio, maya ve kemirgenler5 dahil olmak üzere çeşitli model organizmalar yaygın olarak kullanılmıştır. Bunlar arasında maya en iyi model organizmadır, çünkü genetik manipülasyon kolaydır ve diğer model organizmalardan daha ucuzdur. En önemlisi, maya, insan ortologlarına% 60 dizi homolojisi ve% 25 insan hastalığınabağlı genlerle yakın homoloji 6 gibi insan hücrelerine yüksek benzerliklere sahiptir ve ayrıca temel ökaryotik hücre biyolojisini paylaşırlar. Maya, insan hücrelerindekilere benzer dizilere ve benzer işlevlere sahip birçok protein içerir7. Gerçekten de, insan genlerini ifade eden maya, hücresel süreçleri aydınlatmak için model bir sistem olarak yaygın olarak kullanılmıştır8. Bu maya suşu insanlaştırılmış maya olarak adlandırılır ve insan genlerinin işlevini keşfetmek için yararlı bir araçtır9. İnsanlaştırılmış maya, genetik etkileşimleri incelemek için değerlidir, çünkü genetik manipülasyon mayada iyi kurulmuştur.
Bu çalışmada, Saccharomyces cerevisiae mayasını PD’nin patogenezini incelemek, özellikle α-sinüklein agrega oluşumunu ve sitotoksisiteyi araştırmak için model organizma olarak kullandık10. Tomurcuklanan mayada α-sinükleinin ekspresyonu için, W303a suşu, α-sinükleinin vahşi tip ve ailesel PD ile ilişkili varyantlarını kodlayan plazmidlerle transformasyon için kullanılmıştır. W303a suşu URA3 üzerinde oksotrofik bir mutasyona sahip olduğundan, URA3 ile plazmidler içeren hücrelerin seçimi için geçerlidir. Bir plazmidde kodlanmış α-sinüklein ekspresyonu, GAL1 promotörü altında düzenlenir. Böylece, α-sinükleinin ekspresyon seviyesi kontrol edilebilir. Ek olarak, yeşil floresan proteinin (GFP) α-sinükleinin C-terminal bölgesinde füzyonu, α-sinüklein odaklarının oluşumunun izlenmesini sağlar. α-sinükleinin ailesel PD ile ilişkili varyantlarının özelliklerini anlamak için, bu varyantları mayada da ifade ettik ve hücresel etkilerini inceledik. Bu sistem, α-sinükleinin sitotoksisitesine karşı koruyucu rol oynayan bileşikleri veya genleri taramak için basit bir araçtır.
İnsanlardaki çeşitli hücresel sistemlerin karmaşıklığı göz önüne alındığında, mayayı insan nörodejeneratif hastalıklarını incelemek için bir model olarak kullanmak avantajlıdır. İnsan beyninin karmaşık hücresel etkileşimlerini maya kullanarak araştırmak neredeyse imkansız olsa da, tek hücreli bir bakış açısıyla, maya hücreleri, genomik dizi homolojisi ve temel ökaryotik hücresel süreçler açısından insan hücrelerine yüksek düzeyde benzerliğe sahiptir</sup…
The authors have nothing to disclose.
James Bardwell ve Tiago F. Outeiro’ya α-sinüklein içeren plazmidleri nazikçe paylaştıkları için teşekkür ederiz. Changhan Lee, Kore hükümeti (MSIT) tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı’ndan (NRF) (hibe 2021R1C1C1011690), Eğitim Bakanlığı tarafından finanse edilen NMG aracılığıyla Temel Bilim Araştırma Programı’ndan (hibe 2021R1A6A1A10044950) ve Ajou Üniversitesi’nin yeni fakülte araştırma fonundan fon aldı.
96 well plate | SPL | 30096 | |
Agarose | TAESHIN | 0158 | |
Bacto Agar | BD Difco | 214010 | |
Breathe-easy | diversified biotech | BEM-1 | Gas permeable sealing membrane for microtiter plates |
cover glasses | Marienfeld | 24 x 60 mm | |
Culture tube | SPL | 40014 | |
Cuvette | ratiolab | 2712120 | |
D-(+)-Galactose | sigma | G0625 | |
D-(+)-Glucose | sigma | G8270 | |
D-(+)-Raffinose pentahydrate | Daejung | 6638-4105 | |
Incubator (shaking) | Labtron | model: SHI1 | |
Incubator (static) | Vision scientific | model: VS-1203PV-O | |
LiAc | sigma | L6883 | |
Microplate reader | Tecan | 30050303 01 | Model: Infinite 200 pro |
multichannel pipette 20-200 µL | gilson | FA10011 | |
multichannel pipette 2-20 µL | gilson | FA10009 | |
Olympus microscope | Olympus | IX-53 | |
PEG | sigma | P4338 | average mol wt 3,350 |
Petridish | SPL | 10090 | |
pRS426 | Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. & Hieter, P. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors. Gene. 110 (1), 119-122 (1992). | ||
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A30P | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A53T | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein E46K | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein WT | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
Reservoir | SPL | 23050 | |
Spectrophotometer | eppendorf | 6131 05560 | |
W303a | Present from James Bardwell | ||
Yeast nitrogen base w/o amino acids | Difco | 291940 | |
Yeast synthetic drop-out medium supplements without uracil | sigma | Y1501 | |
YPD | Condalab | 1547.00 |