Um método para estudar a toxicidade e agregação da α-sinucleína usando um modelo de levedura humanizado
Summary
Um modelo fisiológico in vivo de α-sinucleína é necessário para estudar e entender a patogênese da doença de Parkinson. Descrevemos um método para monitorar a citotoxicidade e a formação de agregados de α-sinucleína usando um modelo de levedura humanizado.
Abstract
A doença de Parkinson é o segundo distúrbio neurodegenerativo mais comum e é caracterizada pela morte celular progressiva causada pela formação de corpos de Lewy contendo α-sinucleína mal dobrada e agregada. α-sinucleína é uma proteína pré-sináptica abundante que regula o tráfico de vesículas sinápticas, mas o acúmulo de suas inclusões proteicas resulta em neurotoxicidade. Estudos recentes revelaram que vários fatores genéticos, incluindo chaperonas bacterianas, poderiam reduzir a formação de agregados de α-sinucleína in vitro. No entanto, também é importante monitorar o efeito anti-agregação na célula para aplicá-lo como um tratamento potencial para os pacientes. Seria ideal usar células neuronais, mas essas células são difíceis de manusear e levam muito tempo para exibir o fenótipo anti-agregação. Portanto, uma ferramenta in vivo rápida e eficaz é necessária para a avaliação adicional da atividade antiagregação de vivo. O método aqui descrito foi utilizado para monitorar e analisar o fenótipo antiagregação na levedura humanizada Saccharomyces cerevisiae, que expressou α-sinucleína humana. Este protocolo demonstra ferramentas in vivo que poderiam ser usadas para monitorar a toxicidade celular induzida por α-sinucleína, bem como a formação de agregados de α-sinucleína nas células.
Introduction
A doença de Parkinson (DP) é um problema sério para as sociedades em envelhecimento em todo o mundo. A agregação de α-sinucleína está intimamente associada à DP, e agregados proteicos de α-sinucleína são amplamente utilizados como biomarcador molecular para o diagnóstico da doença1. α-sinucleína é uma pequena proteína ácida (140 aminoácidos de comprimento) com três domínios, a saber, a α-hélice de ligação lipídica N-terminal, o domínio central de ligação a amiloide (NAC) e a cauda ácida C-terminal2. O desdobramento da α-sinucleína pode ocorrer espontaneamente e, eventualmente, leva à formação de agregados amiloides chamados corpos de Lewy3. α-sinucleína pode contribuir para a patogênese da DP de várias maneiras. Em geral, pensa-se que suas formas oligoméricas anormais e solúveis chamadas protofibrilas são espécies tóxicas que causam a morte celular neuronal por afetar vários alvos celulares, incluindo a função sináptica3.
Os modelos biológicos utilizados para estudar doenças neurodegenerativas devem ser relevantes para os seres humanos no que diz respeito ao seu genoma e biologia celular. Os melhores modelos seriam linhagens celulares neuronais humanas. No entanto, essas linhagens celulares estão associadas a diversas questões técnicas, como dificuldades na manutenção das culturas, baixa eficiência da transfecção e alto gasto4. Por estas razões, é necessária uma ferramenta fácil e fiável para acelerar o progresso nesta área de investigação. É importante ressaltar que a ferramenta deve ser fácil de usar para analisar os dados coletados. A partir dessas perspectivas, vários organismos modelo têm sido amplamente utilizados, incluindo Drosophila, Caenorhabditis elegans, Danio rerio, leveduras e roedores5. Entre eles, a levedura é o melhor organismo modelo porque a manipulação genética é fácil e é mais barata do que os outros organismos modelo. Mais importante ainda, a levedura tem altas semelhanças com as células humanas, como 60% de homologia de sequência para ortólogos humanos e 25% de homologia próxima com genes relacionados a doenças humanas6, e eles também compartilham biologia celular eucariótica fundamental. A levedura contém muitas proteínas com sequências semelhantes e funções análogas às das células humanas7. De fato, leveduras que expressam genes humanos têm sido amplamente utilizadas como um sistema modelo para elucidar processos celulares8. Essa cepa de levedura é chamada de levedura humanizada e é uma ferramenta útil para explorar a função dos genes humanos9. A levedura humanizada tem mérito para estudar as interações genéticas porque a manipulação genética está bem estabelecida na levedura.
Neste estudo, utilizamos a levedura Saccharomyces cerevisiae como organismo modelo para estudar a patogênese da DP, particularmente para investigar a formação de agregados de α-sinucleína e citotoxicidade10. Para a expressão de α-sinucleína na levedura em brotamento, a cepa W303a foi utilizada para transformação com plasmídeos codificando para as variantes de α-sinucleína associadas à DP selvagem e familiar. Como a cepa W303a tem uma mutação auxotrófica na URA3, ela é aplicável para a seleção de células contendo plasmídeos com URA3. A expressão de α-sinucleína codificada em um plasmídeo é regulada pelo promotor GAL1. Assim, o nível de expressão da α-sinucleína pode ser controlado. Além disso, a fusão da proteína verde fluorescente (GFP) na região C-terminal da α-sinucleína permite o monitoramento da formação de focos de α-sinucleína. Para entender as características das variantes familiares associadas à DP da α-sinucleína, também expressamos essas variantes em leveduras e examinamos seus efeitos celulares. Este sistema é uma ferramenta simples para a triagem de compostos ou genes que exibem papéis protetores contra a citotoxicidade da α-sinucleína.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dada a complexidade de vários sistemas celulares em humanos, é vantajoso usar levedura como modelo para estudar doenças neurodegenerativas humanas. Embora seja quase impossível investigar as complexas interações celulares do cérebro humano usando leveduras, a partir de uma perspectiva unicelular, as células de levedura têm um alto nível de semelhança com as células humanas em termos de homologia da sequência genômica e processos celulares eucarióticos fundamentais 8,13<su…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a James Bardwell e Tiago F. Outeiro por terem gentilmente partilhado os plasmídeos contendo α-sinucleína. Changhan Lee recebeu financiamento da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF) financiado pelo governo coreano (MSIT) (subsídio 2021R1C1C1011690), o Programa de Pesquisa em Ciência Básica através do NRF financiado pelo Ministério da Educação (subsídio 2021R1A6A1A10044950) e o novo fundo de pesquisa do corpo docente da Universidade de Ajo.
Materials
| 96 well plate | SPL | 30096 | |
| Agarose | TAESHIN | 0158 | |
| Bacto Agar | BD Difco | 214010 | |
| Breathe-easy | diversified biotech | BEM-1 | Gas permeable sealing membrane for microtiter plates |
| cover glasses | Marienfeld | 24 x 60 mm | |
| Culture tube | SPL | 40014 | |
| Cuvette | ratiolab | 2712120 | |
| D-(+)-Galactose | sigma | G0625 | |
| D-(+)-Glucose | sigma | G8270 | |
| D-(+)-Raffinose pentahydrate | Daejung | 6638-4105 | |
| Incubator (shaking) | Labtron | model: SHI1 | |
| Incubator (static) | Vision scientific | model: VS-1203PV-O | |
| LiAc | sigma | L6883 | |
| Microplate reader | Tecan | 30050303 01 | Model: Infinite 200 pro |
| multichannel pipette 20-200 µL | gilson | FA10011 | |
| multichannel pipette 2-20 µL | gilson | FA10009 | |
| Olympus microscope | Olympus | IX-53 | |
| PEG | sigma | P4338 | average mol wt 3,350 |
| Petridish | SPL | 10090 | |
| pRS426 | Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. & Hieter, P. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors. Gene. 110 (1), 119-122 (1992). | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A30P | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A53T | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein E46K | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein WT | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| Reservoir | SPL | 23050 | |
| Spectrophotometer | eppendorf | 6131 05560 | |
| W303a | Present from James Bardwell | ||
| Yeast nitrogen base w/o amino acids | Difco | 291940 | |
| Yeast synthetic drop-out medium supplements without uracil | sigma | Y1501 | |
| YPD | Condalab | 1547.00 |
Referências
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