Un saggio di riduzione solubile a base di tetrazolio per valutare l'effetto degli anticorpi sui biofilm di Candida tropicalis

Summary

Un protocollo basato su piastre di microtitolazione a 96 pozzetti che utilizza un saggio di riduzione di 2,3-bis(2-metossi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-carbossilide-2H-tetrazolio (XTT) è descritto nel presente documento, per studiare gli effetti degli anticorpi sui biofilm formati da C. tropicalis. Questo protocollo in vitro può essere utilizzato per verificare l’effetto di potenziali nuovi composti antifungini sull’attività metabolica delle cellule della specie Candida nei biofilm.

Abstract

Le specie di Candida sono la quarta causa più comune di infezioni nosocomiali sistemiche. La candidosi sistemica o invasiva comporta frequentemente la formazione di biofilm su dispositivi impiantati o cateteri, che è associata ad un aumento della virulenza e della mortalità. I biofilm prodotti da diverse specie di Candida mostrano una maggiore resistenza contro vari farmaci antifungini. Pertanto, vi è la necessità di sviluppare immunoterapie efficaci o trattamenti aggiuntivi contro i biofilm di Candida . Mentre il ruolo dell’immunità cellulare è ben stabilito nella protezione anti-Candida , il ruolo dell’immunità umorale è stato studiato meno.

È stato ipotizzato che l’inibizione della formazione e della maturazione del biofilm sia una delle principali funzioni degli anticorpi protettivi, e gli anticorpi del tubo germinale di Candida albicans (CAGTA) hanno dimostrato di sopprimere la crescita in vitro e la formazione di biofilm di C. albicans in precedenza. Questo articolo delinea un protocollo dettagliato per valutare il ruolo degli anticorpi sui biofilm formati da C. tropicalis. La metodologia per questo protocollo prevede la formazione di biofilm di C. tropicalis in piastre di microtitolazione a 96 pozzetti, che sono state poi incubate in presenza o assenza di anticorpi antigene-specifici, seguite da un saggio 2,3-bis(2-metossi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-carbossilide-2H-tetrazolio (XTT) per misurare l’attività metabolica delle cellule fungine nel biofilm.

La specificità è stata confermata utilizzando appropriati controlli sierici, incluso il siero impoverito di anticorpi Sap2. I risultati dimostrano che gli anticorpi presenti nel siero di animali immunizzati possono inibire la maturazione del biofilm di Candida in vitro. In sintesi, questo articolo fornisce importanti approfondimenti sul potenziale degli anticorpi nello sviluppo di nuove immunoterapie e trattamenti sinergici o aggiuntivi contro i biofilm durante la candidosi invasiva. Questo protocollo in vitro può essere utilizzato per verificare l’effetto di potenziali nuovi composti antifungini sull’attività metabolica delle cellule della specie Candida nei biofilm.

Introduction

La candidosi sistemica è la quarta causa principale di infezioni nosocomiali, che sono associate ad alti tassi di morbilità e mortalità in tutto il mondo. A livello globale, la candidosi sistemica colpisce circa 700.000 individui¹. Le specie di Candida, vale a dire C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata e C. auris, sono la causa più comune di infezioni invasive da Candida ². Le specie di Candida sono patogeni opportunisti che producono biofilm³. I biofilm sono prevalentemente associati alla virulenza della Candida e la Candida può resistere a condizioni di stress ossidativo e osmotico inducendo la formazione di biofilm⁴. I biofilm modulano ulteriormente l’espressione dei fattori di virulenza e dei componenti della parete cellulare e formano una matrice protettiva esopolimerica, aiutando la Candida ad adattarsi a diverse nicchie ospiti⁴. I biofilm contribuiscono all’aderenza del lievito sui tessuti ospiti e sugli strumenti medici⁵. Come tale, la formazione di biofilm è associata a un vantaggio per i lieviti, poiché le cellule di lievito all’interno dei biofilm possono eludere la risposta immunitaria dell’ospite⁶. La formazione di biofilm protegge anche i lieviti patogeni dall’azione dei farmaci antifungini⁵. La ridotta suscettibilità dei biofilm di C. albicans all’amfotericina B è stata dimostrata da Pierce et ^al.7,8. Inoltre, i biofilm dimostrano la resistenza dei farmaci antifungini al fluconazolo, che compromette la gestione efficace della candidosi sistemica ^9,10.

I microbi hanno una tendenza intrinseca ad aderire a varie superfici biotiche e abiotiche, che si traduce nella formazione di biofilm. La Candida albicans, che è un fungo dimorfico, esiste in forme di lievito e ife e la sua formazione di biofilm è stata caratterizzata in vari sistemi modello in vitro e in vivo ¹¹. Le fasi della formazione del biofilm includono l’adesione delle cellule di Candida al substrato, la filamento, la proliferazione e la maturazione del biofilm¹¹. Inizialmente, la forma di lievito di C. albicans aderisce ai substrati, compresi i dispositivi medici e il tessuto umano, seguita dalla filamento e dalla proliferazione di C. albicans in forme ifali e pseudoifali e infine dalla maturazione dei biofilm incorporati nella matrice extracellulare¹¹. La formazione di biofilm contribuisce in gran parte ai meccanismi di patogenesi di C. albicans ¹². Le specie di Candida formano biofilm resistenti ai farmaci, il che rende difficile la loro eradicazione¹³. Un piccolo sottogruppo della popolazione produttrice di biofilm di C. albicans è stato descritto come altamente resistente ai farmaci antifungini amfotericina B e clorexidina¹⁴. Da notare che le cellule di lievito nei biofilm mostrano un’elevata resistenza alla terapia multifarmaco rispetto alle cellule di lievito nella fase planctonica e nella fase^{di proliferazione 14}. È stato suggerito che le cellule di lievito esistenti nei biofilm sono altamente tolleranti ai farmaci antifungini, il che contribuisce alla sopravvivenza di C. albicans nei biofilm¹⁴. Queste cellule esistenti sono state riportate come varianti fenotipiche di C. albicans e non mutanti¹⁴. Inoltre, le cellule dei biofilm di Candida note come “cellule persistenti” sono tolleranti ad alte dosi di trattamento con amfotericina-B e contribuiscono alla sopravvivenza della Candida, ponendo così un grande carico di infezioni sistemiche ricorrenti da Candida in individui ad alto rischio¹⁵.

L’aumento della resistenza ai farmaci antifungini nei ceppi di Candida richiede la ricerca di nuovi agenti antifungini e immunoterapie. Come evidente dagli studi sopra menzionati, i biofilm di Candida mostrano una ridotta suscettibilità ai farmaci antifungini. Pertanto, vi è la necessità di immunoterapie migliorate per controllare la formazione di biofilm di Candida. Studi precedenti hanno dimostrato che CAGTA può fornire una protezione efficace contro le infezioni sistemiche da Candida inibendo la formazione di biofilm di C. albicans in vitro¹⁶. Un altro studio ha riportato che l’immunizzazione dei topi con la proteina RAls3-N di C. albicans induce alti titoli anticorpali che interferiscono con la formazione del biofilm di C. albicans in vitro¹⁷. Gli anticorpi anti-Als3-N hanno anche esercitato un effetto inibitorio sulla dispersione di C. albicans dai biofilm¹⁷. Il vaccino NDV-3A basato su C. albicans è attualmente in fase di sperimentazione clinica e sono stati trovati anche sieri anti-NDV-3A per ridurre la formazione di biofilm di C. auris ¹⁸. Uno studio recente ha identificato l’inibizione della formazione di biofilm da parte degli anticorpi Sap2 come meccanismo di protezione in un modello murino di candidosi sistemica¹⁹.

Questo articolo delinea un protocollo dettagliato in vitro per valutare l’effetto degli anticorpi antigene-specifici presenti nel siero policlonale ottenuto da diversi gruppi di topi vaccinati con Sap2 su biofilm preformati di Candida tropicalis . Per raggiungere questo obiettivo, è stato ottimizzato e sviluppato in laboratorio un metodo basato su un saggio di riduzione XTT, in grado di misurare la vitalità del biofilm in modo rapido, sensibile e ad alta produttività, in presenza o assenza di anticorpi.

Il test XTT viene utilizzato per misurare l’attività metabolica cellulare come indicatore di vitalità cellulare, proliferazione cellulare e citotossicità²⁰. Questo saggio colorimetrico si basa sulla riduzione di un sale giallo di tetrazolio, sodio 3′-[1-(fenilamminocarbonil)-3,4-tetrazolio]-bis (4-metossi-6-nitro) benzene solfonico idrato (XTT) ad un colorante formazan arancione da cellule metabolicamente attive. Poiché solo le cellule vitali possono ridurre XTT, la quantità di formazan XTT ridotta è proporzionale all’intensità del colore e alla vitalità cellulare. Il colorante formazan formato è solubile in acqua e viene quantificato direttamente utilizzando un lettore di piastre. Grazie alla sua natura solubile in acqua, il test XTT consente lo studio di biofilm intatti, nonché l’esame della suscettibilità ai farmaci da biofilm, senza interruzione della struttura del biofilm²¹. Inoltre, questo metodo è implementato nelle valutazioni di vitalità fungina della Candida grazie alla sua facilità d’uso, velocità, precisione, elevata produttività e alto grado di riproducibilità ^7,22.

Oltre al test di riduzione XTT, sono state identificate anche numerose tecniche alternative per la misurazione della quantità di biofilm. Alcuni di questi includono l’uso del saggio di riduzione MTT, la colorazione viola cristallina, la quantificazione del DNA, la PCR quantitativa, la quantificazione delle proteine, la misurazione del peso delle cellule secche e il conteggio delle colonie vitali. Queste procedure variano ampiamente in termini di requisiti di tempo e costi. Taff et al. hanno eseguito un’analisi comparativa di sette diversi saggi di quantificazione del biofilm di Candida e hanno scoperto che il test XTT ha fornito il metodo più riproducibile, accurato ed efficiente per la stima quantitativa dei biofilm di C. albicans ²³. Le tecniche di colorazione come il viola cristallo hanno alcune limitazioni; Il test del cristallo violetto determina indirettamente la quantità di biofilm misurando la densità ottica della matrice e delle cellule del biofilm colorato di cristallo violetto. Sebbene il saggio del cristallo violetto fornisca una buona misura della massa del biofilm, non fornisce una misura della vitalità del biofilm in quanto colora sia le cellule microbiche che la matrice extracellulare²⁴. Dhale et al. hanno inoltre riferito che il test di riduzione XTT era il metodo più sensibile, riproducibile, accurato, efficiente e specifico per rilevare la produzione di biofilm rispetto al saggio di cristallo violetto²⁵. I rapporti di letteratura hanno dimostrato che il test XTT correla bene con il parametro CFU/mL nel metodo di conteggio CFU. Tuttavia, rispetto al test XTT, il metodo CFU è laborioso e lento²⁶. Inoltre, la frazione di cellule vive distaccate potrebbe non essere rappresentativa della popolazione iniziale di biofilm²⁷. Sebbene il test di riduzione XTT sembri la migliore opzione disponibile per quantificare la fattibilità, ci sono alcune limitazioni di questa tecnica. Mentre il metodo XTT è utile per i confronti che coinvolgono un ceppo fungino, il suo uso può essere limitato quando si confrontano diversi ceppi e specie fungine. I confronti tra deformazioni possono essere difficili in assenza di una standardizzazione dettagliata poiché ceppi diversi metabolizzano substrati con capacità diverse²¹.

Protocol

I topi BALB/c sono stati ospitati nella Small Animal Facility di IIT Roorkee. Tutti gli animali sono stati mantenuti in un ciclo luce:buio di 12 h:12 h a 25 °C e sono stati sottoposti a una dieta a pellet e acqua ad libitum. Tutte le procedure animali sono state approvate dall’Institutional Animal Ethics Committee (IAEC) di IIT Roorkee. 1. Preparazione di C. tropicalis NOTA: Il fungo Candida tropicalis appartiene ai patogen…

Representative Results

I biofilm di Candida tropicalis sono stati coltivati in piastre di microtitolazione a 96 pozzetti e sono stati ripresi a 40x utilizzando un microscopio invertito (Figura 1A). Il biofilm è stato ulteriormente colorato usando viola cristallino e osservato a 40x usando un microscopio invertito (Figura 1B). La microscopia elettronica a scansione mostra un’immagine rappresentativa del biofilm di C. tropicalis (Figura 1C</strong…

Discussion

Le infezioni fungine causate dalle specie di Candida sono associate ad alti tassi di morbilità e mortalità in tutto il mondo. La crescente minaccia di infezione fungina invasiva richiede la gestione precoce di tali malattie potenzialmente letali. La maggior parte delle infezioni da Candida comporta la formazione di biofilm, che aderiscono a una varietà di dispositivi medici e sono responsabili della persistenza e della recidiva delle infezioni fungine in ambito ospedaliero³¹. …

Materials

15 mL conical centrifuge tubes	BD Falcon	546021
1x PBS	–	Prepared in lab	NaCl : 4 g KCl : 0.1 g Na2HPO4:  0.72 g KH2PO4 : 0.12 g Water 500 mL. Adjust pH to 7.4
50 mL conical centrifuge tubes	BD Falcon	546041
96-well microtiter plates	Nunc	442404
Incubator	Generic
Menadione	Sigma	M5625
Microtiter Plate Reader	Generic
Multichannel pipette and tips	Generic
Petri dishes	Tarson	460090
Ringers Lactate	–	Prepared in lab	sodium chloride 0.6 g sodium lactate 0.312 g potassium chloride 0.035 g calcium chloride 0.027 g Water 100 mL. Adjust to pH 7.0
RPMI 1640 MOPS	Himedia	AT180
Sabouraud dextrose Agar	SRL	24613
Sabouraud dextrose Broth	SRL	24835
XTT	Invitrogen	X6493