En löslig tetrazoliumbaserad reduktionsanalys för att utvärdera effekten av antikroppar på Candida tropicalis-biofilmer

Summary

Häri beskrivs ett 96-brunns mikrotiterplattbaserat protokoll som använder en 2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenyl)-5-karboxanilid-2H-tetrazolium (XTT) reduktionsanalys för att studera antikroppars effekter på biofilmer bildade av C. tropicalis. Detta in vitro-protokoll kan användas för att kontrollera effekten av potentiella nya svampdödande föreningar på den metaboliska aktiviteten hos Candida-artceller i biofilmer.

Abstract

Candida-arter är den fjärde vanligaste orsaken till systemiska nosokomiala infektioner. Systemisk eller invasiv candidiasis involverar ofta biofilmbildning på implanterade enheter eller katetrar, vilket är förknippat med ökad virulens och dödlighet. Biofilmer som produceras av olika Candida-arter uppvisar ökat motstånd mot olika svampdödande läkemedel. Därför finns det ett behov av att utveckla effektiva immunterapier eller tilläggsbehandlingar mot Candida-biofilmer . Medan rollen som cellulär immunitet är väl etablerad i anti-Candida-skydd , har rollen som humoral immunitet studerats mindre.

Det har antagits att hämning av biofilmbildning och mognad är en av de viktigaste funktionerna för skyddande antikroppar, och Candida albicans bakterierörsantikroppar (CAGTA) har visat sig undertrycka in vitro-tillväxt och biofilmbildning av C. albicans tidigare. Detta dokument beskriver ett detaljerat protokoll för utvärdering av antikroppars roll på biofilmer bildade av C. tropicalis. Metoden för detta protokoll involverar C. tropicalis biofilmbildning i 96-brunns mikrotiterplattor, som sedan inkuberades i närvaro eller frånvaro av antigenspecifika antikroppar, följt av en 2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenyl)-5-karboxanilid-2H-tetrazolium (XTT) analys för mätning av den metaboliska aktiviteten hos svampceller i biofilmen.

Specificiteten bekräftades genom att använda lämpliga serumkontroller, inklusive Sap2-specifikt antikroppsutarmat serum. Resultaten visar att antikroppar som finns i serum hos immuniserade djur kan hämma Candida biofilmmognad in vitro. Sammanfattningsvis ger detta dokument viktiga insikter om antikroppars potential att utveckla nya immunterapier och synergistiska eller kompletterande behandlingar mot biofilmer under invasiv candidiasis. Detta in vitro-protokoll kan användas för att kontrollera effekten av potentiella nya svampdödande föreningar på den metaboliska aktiviteten hos Candida-artceller i biofilmer.

Introduction

Systemisk candidiasis är den fjärde huvudorsaken till nosokomiala infektioner, som är förknippade med hög sjuklighet och dödlighet över hela världen. Globalt påverkar systemisk candidiasis cirka 700 000 individer¹. Candida-arter, nämligen C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata och C. auris, är den vanligaste orsaken till invasiva Candida-infektioner ². Candida-arter är opportunistiska patogener som producerar biofilmer³. Biofilmer är främst associerade med Candida virulens, och Candida kan motstå oxidativa och osmotiska stressförhållanden genom att inducera biofilmbildning⁴. Biofilmer modulerar ytterligare uttrycket av virulensfaktorer och cellväggskomponenter och bildar en exopolymer skyddsmatris, vilket hjälper Candida att anpassa sig till olika värdnischer⁴. Biofilmer bidrar till jästföljsamhet på värdvävnader och medicinska instrument⁵. Som sådan är biofilmbildning associerad med en fördel för jäst, eftersom jästceller i biofilmerna kan undvika värdens immunsvar⁶. Biofilmbildning skyddar också de patogena jästarna från verkan av svampdödande läkemedel⁵. Minskad känslighet för C. albicans biofilmer för amfotericin B har visats av Pierce et ^al.7,8. Dessutom visar biofilmer svampdödande läkemedelsresistens mot flukonazol, vilket försämrar effektiv hantering av systemisk candidiasis ^9,10.

Mikrober har en inneboende tendens att fästa vid olika biotiska och abiotiska ytor, vilket resulterar i biofilmbildning. Candida albicans, som är en dimorf svamp, finns i jäst- och hyphalformer, och dess biofilmbildning har karakteriserats i olika in vitro– och in vivo-modellsystem ¹¹. Stegen i biofilmbildning inkluderar vidhäftning av Candida-celler till substratet, filamentation, proliferation och biofilmmognad¹¹. Ursprungligen fäster jästformen av C. albicans på substrat, inklusive medicintekniska produkter och mänsklig vävnad, följt av filamentation och proliferation av C. albicans i hyphal och pseudohyphal former, och slutligen mognad av biofilmer inbäddade i extracellulär matris¹¹. Biofilmbildning bidrar till stor del till C. albicans patogenesmekanismer¹². Candida-arter bildar läkemedelsresistenta biofilmer, vilket gör deras utrotning utmanande¹³. En liten delmängd av den C. albicans biofilmproducerande populationen har beskrivits som mycket resistent mot de svampdödande läkemedlen amfotericin B och klorhexidin¹⁴. Observera att jästceller i biofilmer uppvisar hög resistens mot multidrogterapi jämfört med jästceller i planktonfasen och proliferationsfas¹⁴. Det har föreslagits att jästceller som finns i biofilmer är mycket toleranta mot svampdödande läkemedel, vilket bidrar till C. albicans överlevnad i biofilmer¹⁴. Dessa befintliga celler rapporterades vara fenotypiska varianter av C. albicans och inte mutanter¹⁴. Dessutom är celler av Candida-biofilmer som kallas “persisterceller” toleranta mot höga doser av amfotericin-B-behandling och bidrar till Candida-överlevnad, vilket utgör en stor börda av återkommande systemiska Candida-infektioner hos högriskindivider ¹⁵.

Ökningen av svampdödande läkemedelsresistens i Candida-stammar kräver forskning för nya svampdödande medel och immunterapier. Som framgår av ovannämnda studier visar Candida biofilmer minskad mottaglighet för svampdödande läkemedel. Därför finns det ett behov av förbättrade immunterapier för att kontrollera Candida biofilmbildning. Tidigare studier har visat att CAGTA kan ge ett effektivt skydd mot systemiska Candidainfektioner genom att hämma C. albicans biofilmbildning in vitro¹⁶. En annan studie rapporterade att immunisering av möss med C. albicans rAls3-N-protein inducerar höga antikroppstitrar som stör C. albicans biofilmbildning in vitro¹⁷. Anti-Als3-N-antikroppar utövade också en hämmande effekt på C. albicans spridning från biofilmer¹⁷. NDV-3A-vaccin baserat på C. albicans är för närvarande under klinisk prövning och anti-NDV-3A-serum visade sig också minska C. auris biofilmbildning¹⁸. En nyligen genomförd studie identifierade hämning av biofilmbildning av Sap2-antikroppar som en skyddsmekanism i en murin modell av systemisk candidiasis¹⁹.

Detta dokument beskriver ett detaljerat in vitro-protokoll för utvärdering av effekten av antigenspecifika antikroppar närvarande i polyklonalt serum erhållet från olika grupper av Sap2-vaccinerade möss på förformade Candida tropicalis-biofilmer . För att uppnå detta optimerades och utvecklades en metod baserad på en XTT-reduktionsanalys i laboratoriet, som kan mäta biofilmens livskraft på ett snabbt, känsligt och högt genomströmningssätt, i närvaro eller frånvaro av antikroppar.

XTT-analysen används för att mäta cellulär metabolisk aktivitet som en indikator på cellviabilitet, cellulär proliferation och cytotoxicitet²⁰. Denna kolorimetriska analys är baserad på reduktionen av ett gult tetrazoliumsalt, natrium 3′-[1-(fenylaminokarbonyl)-3,4-tetrazolium]-bis (4-metoxi-6-nitro) bensensulfonsyrahydrat (XTT) till ett orange formazanfärgämne av metaboliskt aktiva celler. Eftersom endast livskraftiga celler kan minska XTT är mängden reducerad XTT-formazan proportionell mot intensiteten av färg och cellviabilitet. Det formazanfärgade färgämnet som bildas är vattenlösligt och kvantifieras direkt med hjälp av en plattläsare. På grund av sin vattenlösliga natur tillåter XTT-analysen studier av intakta biofilmer, liksom undersökning av biofilmläkemedelskänslighet, utan störning av biofilmstruktur²¹. Dessutom implementeras denna metod i Candida svamp livskraft bedömningar på grund av dess användarvänlighet, hastighet, noggrannhet, hög genomströmning, och hög grad av reproducerbarhet ^7,22.

Förutom XTT-reduktionsanalysen har många alternativa tekniker också identifierats för mätning av biofilmkvantitet. Några av dessa inkluderar användningen av MTT-reduktionsanalysen, kristallviolett färgning, DNA-kvantifiering, kvantitativ PCR, proteinkvantifiering, torrcellsviktmätning och livskraftig koloniräkning. Dessa förfaranden varierar mycket när det gäller deras tids- och kostnadskrav. utförde en jämförande analys av sju olika Candida-biofilmkvantifieringsanalyser och fann att XTT-analysen gav den mest reproducerbara, exakta och effektiva metoden för kvantitativ uppskattning av C. albicans biofilmer²³. Färgningstekniker som kristallviolett har vissa begränsningar; Det kristallvioletta testet bestämmer indirekt mängden biofilm genom att mäta den optiska densiteten hos den kristallviolettfärgade biofilmmatrisen och cellerna. Även om den kristallvioletta analysen ger ett bra mått på biofilmmassa, ger den inte ett mått på biofilmens livskraft eftersom den fläckar både mikrobiella celler och den extracellulära matrisen²⁴. rapporterade vidare att XTT-reduktionsanalysen var den mest känsliga, reproducerbara, exakta, effektiva och specifika metoden för att detektera biofilmproduktion jämfört med kristallviolett analys²⁵. Litteraturrapporter har visat att XTT-analysen korrelerar väl med CFU/ml-parametern i CFU-räkningsmetoden. Men jämfört med XTT-analysen är CFU-metoden arbetsintensiv och långsam²⁶. Dessutom kan det hända att andelen fristående levande celler inte är representativ för den ursprungliga biofilmpopulationen²⁷. Även om XTT-reduktionsanalysen verkar vara det bästa tillgängliga alternativet för att kvantifiera lönsamheten, finns det några begränsningar med denna teknik. Medan XTT-metoden är användbar för jämförelser som involverar en svampstam, kan dess användning vara begränsad när man jämför olika svampstammar och arter. Interstrain jämförelser kan vara svåra i avsaknad av detaljerad standardisering eftersom olika stammar metaboliserar substrat med olika kapacitet²¹.

Protocol

BALB/c-möss inhystes i smådjursanläggningen vid IIT Roorkee. Alla djur hölls i en 12 h:12 h ljus:mörk cykel vid 25 °C och försågs med en pelletsdiet och vatten ad libitum. Alla djurförsök godkändes av IIT Roorkees institutionella djurförsöksetiska kommitté (IAEC). 1. Beredning av C. tropicalis OBS: Svampen Candida tropicalis tillhör riskgrupp 2-patogener och klassificeras som en BSL2-mikroorganism. Använd all…

Representative Results

Candida tropicalis biofilmer odlades i 96-brunns mikrotiterplattor och avbildades vid 40x med hjälp av ett inverterat mikroskop (figur 1A). Biofilmen färgades vidare med kristallviolett och observerades vid 40x med hjälp av ett inverterat mikroskop (figur 1B). Svepelektronmikroskopi visar en representativ bild av C. tropicalis biofilm (figur 1C). För att utföra biofilmhämningsanalysen tillsattes 105</sup…

Discussion

Svampinfektioner orsakade av Candida-arter är förknippade med hög sjuklighet och dödlighet över hela världen. Det växande hotet om invasiv svampinfektion kräver tidig hantering av sådana livshotande sjukdomar. De flesta Candida-infektioner involverar bildandet av biofilmer, som följer en mängd olika medicintekniska produkter och är ansvariga för uthållighet och återkommande svampinfektioner i sjukhusinställningar³¹. Biofilmer består av jäst- eller hyphalceller, …

Materials

15 mL conical centrifuge tubes	BD Falcon	546021
1x PBS	–	Prepared in lab	NaCl : 4 g KCl : 0.1 g Na2HPO4:  0.72 g KH2PO4 : 0.12 g Water 500 mL. Adjust pH to 7.4
50 mL conical centrifuge tubes	BD Falcon	546041
96-well microtiter plates	Nunc	442404
Incubator	Generic
Menadione	Sigma	M5625
Microtiter Plate Reader	Generic
Multichannel pipette and tips	Generic
Petri dishes	Tarson	460090
Ringers Lactate	–	Prepared in lab	sodium chloride 0.6 g sodium lactate 0.312 g potassium chloride 0.035 g calcium chloride 0.027 g Water 100 mL. Adjust to pH 7.0
RPMI 1640 MOPS	Himedia	AT180
Sabouraud dextrose Agar	SRL	24613
Sabouraud dextrose Broth	SRL	24835
XTT	Invitrogen	X6493