Dit protocol beschrijft een semi-geautomatiseerde methode voor medium- tot high-throughput organoïde medicijnscreenings en microscoop-agnostische, geautomatiseerde beeldanalysesoftware om multiparametrische, single-organoïde geneesmiddelresponsen te kwantificeren en te visualiseren om intratumor heterogeniteit vast te leggen.
Patiënt-afgeleide tumororganoïden (PDTO’s) houden een grote belofte in voor preklinisch en translationeel onderzoek en het voorspellen van de respons op patiënttherapie van ex vivo medicijnscreenings. De huidige op adenosinetrifosfaat (ATP) gebaseerde screeningstests voor geneesmiddelen leggen echter niet de complexiteit vast van een geneesmiddelrespons (cytostatisch of cytotoxisch) en intratumorheterogeniteit waarvan is aangetoond dat deze in PDO’s wordt behouden als gevolg van een bulkuitlezing. Live-cell imaging is een krachtig hulpmiddel om dit probleem te overwinnen en medicijnreacties diepgaander te visualiseren. Beeldanalysesoftware is echter vaak niet aangepast aan de driedimensionaliteit van PDO’s, vereist fluorescerende levensvatbaarheidskleurstoffen of is niet compatibel met een 384-well microplaatformaat. Dit artikel beschrijft een semi-geautomatiseerde methodologie om PDTO’s te zaaien, behandelen en af te beelden in een high-throughput, 384-well-formaat met behulp van conventionele, widefield, live-cell imaging-systemen. Daarnaast hebben we levensvatbaarheidsmarkervrije beeldanalysesoftware ontwikkeld om op groeisnelheid gebaseerde geneesmiddelresponsstatistieken te kwantificeren die de reproduceerbaarheid verbeteren en groeisnelheidsvariaties tussen verschillende PDTO-lijnen corrigeren. Met behulp van de genormaliseerde geneesmiddelresponsmaatstaf, die de geneesmiddelrespons scoort op basis van de groeisnelheid genormaliseerd tot een positieve en negatieve controletoestand, en een fluorescerende celdoodkleurstof, kunnen cytotoxische en cytostatische geneesmiddelresponsen gemakkelijk worden onderscheiden, waardoor de classificatie van responders en non-responders aanzienlijk wordt verbeterd. Bovendien kan heterogeniteit van de geneesmiddelrespons worden gekwantificeerd uit single-organoïde geneesmiddelresponsanalyse om potentiële, resistente klonen te identificeren. Uiteindelijk is deze methode bedoeld om de voorspelling van de klinische therapierespons te verbeteren door een multiparametrische medicijnresponssignatuur vast te leggen, waaronder kinetische groeistilstand en celdoodkwantificering.
In de afgelopen jaren zijn in vitro kankergeneesmiddelontdekking, medicijnscreening en fundamenteel onderzoek overgegaan van het gebruik van traditionele tweedimensionale (2D) kankermodellen met onsterfelijke cellijnen naar meer fysiologisch relevante driedimensionale (3D) kankermodellen. Dit heeft de adoptie van tumorsferoïden met gevestigde kankercellijnen gestimuleerd, die complexere cel-tot-cel interacties en structuren in solide tumoren recreëren. Momenteel zijn patiënt-afgeleide tumororganoïden (PDTO’s) het meest geavanceerde en fysiologisch relevante 3D-kankermodel dat beschikbaar is voor in vitro kankeronderzoek, omdat ze extra voordelen bieden ten opzichte van tumorsferoïden, namelijk de heterogeniteit die wordt aangetroffen bij kankerpatiënten1. BOBTO’s worden vastgesteld op basis van tumorweefsel afkomstig van kankerpatiënten en behouden daarom zowel het tumorfenotype als het genotype. Als zodanig worden PDTO’s van onschatbare waarde voor fundamenteel en translationeel kankeronderzoek en hebben ze het potentieel om precisie-oncologie aanzienlijk te verbeteren2.
Ondanks hun veelbelovende potentieel worden deze geavanceerde 3D in vitro kankermodellen vaak onderbenut door een gebrek aan geavanceerde analysemethoden. De meest gebruikte assay bepaalt het aantal levensvatbare cellen in de PDTO via de kwantificering van intracellulaire ATP3. Deze assays zijn normaal gesproken single-timepoint, bulkanalyses, waardoor kritische tijdsafhankelijke responsen over het hoofd worden gezien en klonale responsen worden verwaarloosd. In het bijzonder is het vermogen om de groei van PDO’s (groeisnelheid) en hun reactie op specifieke therapieën te volgen van groot belang 4,5. De genormaliseerde geneesmiddelrespons (NDR), die de geneesmiddelrespons scoort op basis van de groeisnelheid genormaliseerd tot een positieve (ctrl +) en negatieve controle (ctrl-) aandoening, is onlangs ook gemeld als een cruciale maatstaf voor het evalueren van de gevoeligheid van kankergeneesmiddelen met celgebaseerde screening, hoewel dit voornamelijk werd gedaan voor 2D-cellijnen6. Daarom zijn meer geavanceerde analysemethoden nodig om volledig te profiteren van deze meer klinisch representatieve en complexe 3D-kankermodellen. Microscopie wordt beschouwd als een krachtige benadering om de complexiteit van deze organoïde modellen tebestuderen 7.
Dit artikel beschrijft een methode voor het monitoren van kinetische medicijnresponsen in 3D-kankermodellen, met behulp van conventionele widefield microscopen en live-cell imaging-systemen. Er zijn aanpassingen gedaan aan het protocol beschreven door Driehuis et al.4 om compatibel te zijn met automatisering met behulp van een pipetteerrobot, digitale medicijndispenser en live-cell imaging-systeem om de reproduceerbaarheid te vergroten en het aantal ‘hands-on’ arbeidsuren te verminderen. Deze methode maakt medium- tot high-throughput geneesmiddelenscreening mogelijk van zowel tumorsferoïden met gevestigde kankercellijnen (zie aanvullende tabel S1 voor geteste cellijnen), als de PDTO’s, in een 384-well microplaat en multi-organoïde formaat. Door gebruik te maken van een convolutioneel netwerk machine learning-proces, kon geautomatiseerde identificatie en tracking van individuele tumorsferoïden of PDTO’s uitsluitend worden uitgevoerd op basis van brightfield-beeldvorming en zonder het gebruik van fluorescerende levendcellige etiketteringskleurstoffen8. Dit is zeer voordelig, omdat de meeste identificatie met brightfield-beeldvorming handmatige annotatie vereist (wat bewerkelijk en tijdrovend is) of de toevoeging van fluorescerende kleurstoffen vereist, die medicijnreacties met betrekking tot door fotoxicity geïnduceerde oxidatieve stress kunnen verstoren9.
De resulterende beeldanalysesoftware die in eigen huis is ontwikkeld, breidt de functionaliteit van conventionele live-cell imaging-systemen uit, omdat 3D-beeldanalysemodules niet beschikbaar, platformbeperkt of niet compatibel zijn met 384-well microplaten en whole-well imaging. Bovendien zijn deze modules vaak hoog geprijsd en bieden ze beperkte bulk organoïde uitlezingen. Daarom is deze methode zeer relevant voor wetenschappers die toegang hebben tot algemeen beschikbare live-cell imaging-systemen en ernaar streven meer informatie over een medicijnrespons te extraheren in vergelijking met de gouden standaard maar rudimentaire ATP-gebaseerde test. Met de toevoeging van specifieke celdoodindicatoren kunnen cytostatische geneesmiddelresponsen worden onderscheiden van cytotoxische responsen, waardoor meer inzicht wordt verkregen in mechanistische geneesmiddelacties die momenteel onbereikbaar zijn uit single-timepoint-analyse. Ten slotte maakt live-cell imaging het mogelijk om individuele organoïde tracking te verkrijgen om single organoid drug response metrics te verkrijgen om respons heterogeniteit vast te leggen en potentiële resistente subclones te identificeren.
Het doel van deze methode en de bijbehorende beeldanalysesoftware is om goedkope automatisering te implementeren in organoïde geneesmiddelenscreening om gebruikersinterventie te beperken en variabiliteit in verwerking, beeldanalyse en gegevensanalyse te verminderen. Om deze software beschikbaar te maken voor onderzoekers, is het microscoop- en platformonafhankelijk en wordt een cloudgebaseerde applicatie beschikbaar gesteld. Door conventionele live-cell imaging-systemen te ondersteunen, willen we dus ook hun functionaliteit voor 3D-kweektoepassingen en -analyse verbeteren.
Pdto-geneesmiddelenscreening met gemiddelde tot hoge doorvoer is vaak afhankelijk van uitlezingen die slechts een fractie van de informatie extraheren die organoïden mogelijk kunnen bieden. Het is steeds duidelijker geworden dat, om de snel evoluerende organoïde technologie een groter wetenschappelijk en klinisch potentieel te laten realiseren, meer geavanceerde 3D-testen, uitlezingen en analysemethoden van cruciaal belang zijn. Hier wordt een geavanceerde screeningspijplijn beschreven, die niet alleen de reproduceerbaarheid verhoogt, maar ook de klinische vertaalbaarheid aanzienlijk verbetert door een AI-gestuurde, live-cell imaging-uitlezing op te nemen. Naast de in eigen huis ontwikkelde analysesoftware wordt het gebruik van de genormaliseerde drug response metric (NDR) geïmplementeerd, wat duidelijk aantoont dat het in staat is om patiëntspecifieke verschillen in behandelingsresponste definiëren 6.
De opname van deze normalisatiemaatstaf zal ongetwijfeld van enorme waarde zijn, eraan herinnerend dat talrijke studies gericht zijn op het afbakenen van behandelingsresponsen op basis van kleine verschillen in gebied onder de curve (AUC) of half-maximale remmende concentratie (IC50) (aangezien de meeste dosis-responscurven elkaar overlappen / dicht bij elkaar bevinden)11,12 . Groeisnelheidsstatistieken zijn al geïmplementeerd in organoïde medicijnscreeningprotocollen met behulp van de ATP-gebaseerde test, maar vertrouwen op de normalisatie van referentieputten die op tijdstip 04 zijn gelyseerd. Daarentegen maakt deze methode intrawell-groeisnelheidsnormalisatie mogelijk, wat niet alleen rekening houdt met interpatiente verschillen in PDTO-groeisnelheid, maar ook interwell-verschillen als gevolg van variaties in zaaidichtheid en plaatlocatieafhankelijke effecten om de reproduceerbaarheid te vergroten. Bovendien hebben we de NDR aangepast om de scheiding van interpatlinische PDTO-respons verder te vergroten door een positieve controle voor normalisatieop te nemen 6,8.
Bovendien kan de analyse, die compatibel is met high-throughput en automatiseringsformaten, individuele organoïde reacties nauwkeurig detecteren, waardoor de kwantificering van subklonale resistentie mogelijk wordt – de belangrijkste drijvende kracht achter tumorrecidieven en progressie13. Hoewel PDAC052 en PDAC060 bijvoorbeeld een goede respons op de behandeling in vitro vertoonden (gebaseerd op de NDR), was de aanvullende single-organoïde analyse in staat om een kleine (grotere populatie met PDAC060) populatie van subclonen te detecteren die niet reageren op de behandeling. Interessant is dat dit sterk overeenkwam met de klinische observatie, gezien het feit dat PDAC052 en PDAC060 een duurzame respons hadden (geen tumoractiviteit gedetecteerd) maar uiteindelijk beide werden gediagnosticeerd met lokale tumorprogressie (vanwege de aanwezigheid van resistente klonen). In vergelijking met de conventionele 3D-uitlezingen (ATP-gebaseerde test en grootte / cijfers), wordt verwacht dat deze geavanceerde screeningspijplijn de voorspellende prestaties zal verhogen door meer klinisch relevante informatie uit deze ‘patiënten-in-het-laboratorium’ te extraheren. Deze hypothese wordt nu getest door klinische PDTO-monsters in het laboratorium van de auteurs te screenen met deze methode om ex vivo te correleren met in vivo respons en klinische uitkomst.
Om meer inzicht te krijgen in de mechanismen van een geneesmiddelrespons, zijn conventionele fluorescerende levende celbeeldvormende reagentia, naast cytotoxiciteitskleurstoffen, compatibel met deze methode om mechanismen van celdood te bestuderen. We hebben eerder de compatibiliteit van deze methode met het Sartorius Caspase 3/7 Green Reagens aangetoond om caspase-afhankelijke inductie van apoptose na cisplatinebehandelingte bestuderen 8. De compatibiliteit met andere kleurstoffen voor het bestuderen van oxidatieve stress (CellROX-reagentia) of hypoxie (Image-iT Hypoxie-reagentia) moet nog worden getest. Deze reagentia zijn echter al met succes gebruikt in 3D in vitro modellen14,15.
De beeldanalysesoftware is ook compatibel met andere plaatformaten of kweekmethoden (bijv. Microcavity-platen, ECM-koepels) als duidelijke, onscherpe beelden van de organoïden kunnen worden vastgelegd. Dit is vaak een uitdaging voor organoïden gekweekt in koepels, omdat ze in verschillende z-vlakken groeien, wat z-stacking-functionaliteit van de microscoop vereist die niet altijd beschikbaar is. Daarom adviseren wij het gebruik van platte ULA 384-well microplaten om beelden van voldoende kwaliteit te garanderen.
Bovendien is de analyse compatibel met andere live-cell imaging-systemen, zoals eerder werd getoond voor fasecontrastbeelden die zijn vastgelegd met een IncuCyte ZOOM-systeem8. Een beperking van het Spark Cyto live-cell imaging systeem dat in dit manuscript werd gebruikt, is de capaciteit van één plaat voor kinetische metingen. De Spark Motion-uitbreiding verhoogt echter de capaciteit tot maximaal 40 microplaten die in bulk kunnen worden gescreend. De compatibiliteit van de in eigen huis ontwikkelde software zal worden uitgebreid naar deze en andere systemen om een platform-agnostische oplossing te bieden, met als doel beeld- en data-analysepijplijnen te standaardiseren en te automatiseren. De webgebaseerde applicatie zal ook interactieve grafische tools en geautomatiseerde metrische berekeningen van geneesmiddelen bevatten, zoals weergegeven in dit artikel, om de handmatige analysetijd te verkorten.
Het labelvrije PDTO-segmentatiealgoritme werd getraind en getest op verschillende in eigen huis gekweekte sferoïde- en PDTO-modellen met duidelijke morfologische verschillen (solide, halfvast, cystisch) en kan deze bijgevolg met hoge nauwkeurigheid detecteren8. Een beperking van het model is dat de opname van cystische PDO’s de ongewenste detectie van bubbels in de put na het zaaien verhoogde. Nachtelijke incubatie was echter voldoende om de meeste van deze bubbels te verwijderen, waardoor een kwalitatieve tijdspunt 0-scan mogelijk was. De nauwkeurigheid van de organoïde beeldsegmentatie en de methode moet door andere gebruikers worden gevalideerd en op basis van hun feedback kan de software verder worden getraind om een robuust en geautomatiseerd beeldanalysealgoritme te verkrijgen. Daarnaast streven we ernaar meer klinische gegevens te verkrijgen om de ex vivo geneesmiddelrespons die door deze methode wordt gekwantificeerd, te correleren met de klinische respons bij de patiënt om de beste parameters te identificeren om de therapierespons te voorspellen en deze methode voor functionele precisiekankergeneeskunde verder te ontwikkelen16.
The authors have nothing to disclose.
Een deel van dit onderzoek werd gefinancierd door giften van verschillende donateurs, waaronder Dedert Schilde vzw en de heer Willy Floren. Dit werk wordt gedeeltelijk gefinancierd door de Vlaamse Stichting voor Onderzoek, 12S9221N (A.L.), G044420N (S.V., A.L., E.G), 1S27021N (M.L.), en door het Fonds voor Industrieel Onderzoek van de Universiteit Antwerpen, PS ID 45151 (S.V., A.L., C.D.). Figuur 1 is gemaakt met BioRender.com.
6-well plate | Greiner | 657160 | |
8-Channel p300 (GEN 2) pipette | Opentrons | ||
300 µL Tips | Opentrons | ||
384-well flat-bottom ULA microplate | Corning | 4588 | minimum volume 50 µL |
384-well flat-bottom ULA Phenoplate | Perkin Elmer | 6057802 | minimum volume 75 µL |
A8301 | Tocris Bioscience | 2939 | |
ADF+++ | Advanced DMEM/F12, 1% GlutaMAX, 1% HEPES, 1% penicillin/streptomycin | ||
Advanced DMEM/F-12 | ThermoFisher Scientific | 12634 | |
B27 | ThermoFisher Scientific | 17504044 | |
Breathe easy sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z380059 | |
Caspase 3/7 Green | Sartorius | 4440 | |
Cell Counting Slides for TC10/TC20 | Bio-Rad Laboratories | 1450017 | |
CellTiter-Glo 3D | Promega | G9681 | ATP-assay |
Cooler for 25 mL reservoir | VWR (Diversified Biotech) | 490006-908 | |
Cooling element 12 x 8 x 3 cm | Bol.com | 9200000107744702 | For custom microplate holder OT-2 |
Cultrex Organoid Harvesting Solution | R&D systems | 3700-100-01 | |
Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2 | R&D systems | 3533-010-02 | extracellular matrix (ECM) |
Cytotox Green | Sartorius | 4633 | |
Cytotox Red | Sartorius | 4632 | |
D300e | Tecan | Digital drug dispenser | |
D300e Control v3.3.5 | Tecan | Control software D300e | |
FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
Full Medium | ADF+++ supplemented with 0.5 nM WNT surrogate-Fc-Fusion protein, 4% Noggin-Fc Fusion Protein conditioned medium, 4% Rpso3-Fc Fusion Protein conditioned medium, 1x B27, 1 mM N-acetyl cysteine (NAC), 5 mM nicotinamide, 500 nM A83-01, 100 ng/mL FGF10, and 10 nM Gastrin | ||
Gastrin | Sigma-Aldrich | G9145 | |
Gemcitabine | Selleck Chemicals | S1714 | |
GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 35050 | |
HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630056 | |
Hoechst 33342 Solution (20 mM) | ThermoFisher Scientific | 62259 | |
Human pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) patient-derived organoids | Biobank@uza (Antwerp, Belgium; ID: BE71030031000; Belgian Virtual Tumorbank funded by the National Cancer Plan) | ||
N-acetyl-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-25G | |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | |
Noggin-Fc Fusion Protein conditioned medium | Immunoprecise | N002 | |
Opentrons App v6.0.1 | Opentrons | OT-2 control software | |
Opentrons Protocol Designer Tool | Opentrons | https://designer.opentrons.com/ | |
Orbits data compression tool | www.orbits-oncology.com or contact corresponding author | ||
Orbits image analysis webapp | University of Antwerp | www.orbits-oncology.com or contact corresponding author | |
OT-2 | Opentrons | Pipetting robot | |
Paclitaxel | Selleck Chemicals | S1150 | |
Pasteur Pipette 230 mm | Novolab | A33696 | |
Peniciline-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140 | |
Prism 9 | GraphPad | ||
Rspo3-Fc Fusion Protein conditioned medium | Immunoprecise | N003 | |
Spark Cyto 600 | Tecan | Live-cell imaging and multi-mode platereader | |
SparkControl v3.1 | Tecan | Spark Cyto control software | |
Staurosporine | Tocris Bioscience | 1285 | |
Sterile 25 mL reservoir | VWR (Diversified Biotech) | 10141-922 | |
T8 plus cassette | Tecan | ||
TC20 | Bio-Rad Laboratories | automated cell counter | |
TrypLE | ThermoFisher Scientific | 12604-021 | dissociation enzyme |
Tween-20 | Acros Organics | 233360010 | |
WNT Surrogate-Fc-Fusion protein | Immunoprecise | N001 | |
Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 |