Ce protocole décrit une méthode semi-automatisée pour les criblages de médicaments organoïdes à débit moyen à élevé et un logiciel d’analyse d’images automatisé indépendant du microscope pour quantifier et visualiser les réponses multiparamétriques et mono-organoïdes aux médicaments afin de capturer l’hétérogénéité intratumorale.
Les organoïdes tumoraux dérivés du patient (PDTO) sont très prometteurs pour la recherche préclinique et translationnelle et la prédiction de la réponse thérapeutique du patient à partir de criblages de médicaments ex vivo . Cependant, les tests actuels de dépistage de médicaments basés sur l’adénosine triphosphate (ATP) ne saisissent pas la complexité d’une réponse médicamenteuse (cytostatique ou cytotoxique) et l’hétérogénéité intratumorale qui s’est avérée retenue dans les PDTO en raison d’une lecture globale. L’imagerie de cellules vivantes est un outil puissant pour surmonter ce problème et visualiser les réponses aux médicaments plus en profondeur. Cependant, les logiciels d’analyse d’images ne sont souvent pas adaptés à la tridimensionnalité des PDTO, nécessitent des colorants de viabilité fluorescents ou ne sont pas compatibles avec un format de microplaque à 384 puits. Cet article décrit une méthodologie semi-automatisée pour ensemencer, traiter et imager des PDTO dans un format à haut débit de 384 puits à l’aide de systèmes d’imagerie conventionnels à champ large et à cellules vivantes. En outre, nous avons développé un logiciel d’analyse d’images sans marqueur de viabilité pour quantifier les mesures de réponse aux médicaments basées sur le taux de croissance qui améliorent la reproductibilité et corrigent les variations de taux de croissance entre les différentes lignées PDTO. En utilisant la mesure de réponse normalisée aux médicaments, qui évalue la réponse au médicament en fonction du taux de croissance normalisé à une condition de contrôle positive et négative, et un colorant de mort cellulaire fluorescent, les réponses cytotoxiques et cytostatiques aux médicaments peuvent être facilement distinguées, améliorant considérablement la classification des répondeurs et des non-répondeurs. En outre, l’hétérogénéité de la réponse aux médicaments peut être quantifiée à partir de l’analyse de la réponse aux médicaments organoïde unique pour identifier des clones potentiels et résistants. En fin de compte, cette méthode vise à améliorer la prédiction de la réponse thérapeutique clinique en capturant une signature multiparamétrique de réponse au médicament, qui comprend l’arrêt de la croissance cinétique et la quantification de la mort cellulaire.
Au cours des dernières années, la découverte in vitro de médicaments contre le cancer, le dépistage de médicaments et la recherche fondamentale sont passés de l’utilisation de modèles de cancer bidimensionnels traditionnels (2D) avec des lignées cellulaires immortalisées à des modèles de cancer tridimensionnels (3D) plus pertinents sur le plan physiologique. Cela a stimulé l’adoption de sphéroïdes tumoraux avec des lignées cellulaires cancéreuses établies, qui recréent des interactions et des structures de cellule à cellule plus complexes présentes dans les tumeurs solides. Actuellement, les organoïdes tumoraux dérivés de patients (PDTO) sont le modèle de cancer 3D le plus avancé et physiologiquement pertinent disponible pour la recherche in vitro sur le cancer, car ils offrent des avantages supplémentaires par rapport aux sphéroïdes tumoraux, à savoir l’hétérogénéité trouvée chez les patients cancéreux1. Les PDTO sont établis à partir de tissus tumoraux provenant de patients cancéreux et conservent donc à la fois le phénotype tumoral et le génotype. En tant que tels, les PDTO deviennent inestimables pour la recherche fondamentale et translationnelle sur le cancer et ont le potentiel d’améliorer considérablement la précision de l’oncologie2.
Malgré leur potentiel prometteur, ces modèles 3D sophistiqués de cancer in vitro sont souvent sous-utilisés en raison d’un manque de méthodes d’analyse avancées. Le test le plus couramment utilisé détermine le nombre de cellules viables dans le PDTO via la quantification de l’ATP3 intracellulaire. Ces tests sont normalement des analyses globales à point temporel unique, négligeant ainsi les réponses critiques dépendantes du temps et négligeant les réponses clonales. Plus précisément, la capacité de surveiller la croissance des PDTO (taux de croissance) et leur réponse à des thérapies spécifiques présente un grand intérêt 4,5. La réponse normalisée aux médicaments (NDR), qui évalue la réponse au médicament en fonction du taux de croissance normalisé à une condition positive (ctrl+) et de contrôle négatif (ctrl-), a également été récemment considérée comme une mesure cruciale pour évaluer la sensibilité aux médicaments anticancéreux avec le dépistage cellulaire, bien que cela ait été principalement fait pour les lignées cellulaires2D 6. Par conséquent, des méthodes d’analyse plus sophistiquées sont nécessaires pour tirer pleinement parti de ces modèles de cancer 3D plus représentatifs et plus complexes sur le plan clinique. La microscopie est considérée comme une approche puissante pour étudier la complexité de ces modèles organoïdes7.
Cet article décrit une méthode de surveillance des réponses cinétiques aux médicaments dans des modèles 3D de cancer, à l’aide de microscopes à grand champ conventionnels et de systèmes d’imagerie de cellules vivantes. Des adaptations ont été apportées au protocole décrit par Driehuis et al.4 pour être compatible avec l’automatisation à l’aide d’un robot de pipetage, d’un distributeur numérique de médicaments et d’un système d’imagerie de cellules vivantes afin d’augmenter la reproductibilité et de réduire le nombre d’heures de travail « pratique ». Cette méthode permet le criblage médicamenteux à débit moyen à élevé des sphéroïdes tumoraux avec des lignées cellulaires cancéreuses établies (voir le tableau supplémentaire S1 pour les lignées cellulaires testées), ainsi que des PDTO, dans un format microplaque et multi-organoïde à 384 puits. En utilisant un processus d’apprentissage automatique en réseau convolutionnel, l’identification et le suivi automatisés des sphéroïdes tumoraux individuels ou PDTO pourraient être effectués uniquement à partir de l’imagerie en fond clair et sans l’utilisation de colorants fluorescents pour le marquage des cellules vivantes8. Ceci est très avantageux, car la plupart des identifications avec l’imagerie en fond clair nécessitent une annotation manuelle (ce qui est laborieux et prend beaucoup de temps) ou nécessitent l’ajout de colorants fluorescents, ce qui peut confondre les réponses médicamenteuses liées au stress oxydatif induit par la photoxicité9.
Le logiciel d’analyse d’images qui en résulte, développé en interne, étend les fonctionnalités des systèmes d’imagerie de cellules vivantes conventionnels, car les modules d’analyse d’images 3D ne sont pas disponibles, limités par la plate-forme ou ne sont pas compatibles avec les microplaques 384 puits et l’imagerie de puits entiers. De plus, ces modules sont souvent très chers et offrent des lectures organoïdes en vrac limitées. Par conséquent, cette méthode est très pertinente pour les scientifiques qui ont accès à des systèmes d’imagerie de cellules vivantes largement disponibles et visent à extraire plus d’informations sur une réponse médicamenteuse par rapport au test de référence mais rudimentaire basé sur l’ATP. Avec l’ajout d’indicateurs spécifiques de mort cellulaire, les réponses cytostatiques aux médicaments peuvent être distinguées des réponses cytotoxiques, fournissant ainsi un aperçu supplémentaire des actions mécanistes des médicaments actuellement inaccessibles à partir d’une analyse ponctuelle unique. Enfin, l’imagerie de cellules vivantes permet un suivi organoïde individuel pour obtenir des mesures de réponse aux médicaments organoïdes uniques afin de saisir l’hétérogénéité de la réponse et d’identifier les sous-clones potentiellement résistants.
L’objectif de cette méthode et du logiciel d’analyse d’images associé est de mettre en œuvre une automatisation à faible coût dans le dépistage de médicaments organoïdes afin de limiter l’intervention des utilisateurs et de réduire la variabilité dans la manipulation, l’analyse d’images et l’analyse de données. Pour mettre ce logiciel à la disposition des chercheurs, il est indépendant du microscope et de la plate-forme, et une application basée sur le cloud est mise à disposition. Ainsi, en prenant en charge les systèmes conventionnels d’imagerie de cellules vivantes, nous visons également à améliorer leur fonctionnalité pour les applications et l’analyse de culture 3D.
Le dépistage des médicaments PDTO à débit moyen à élevé repose souvent sur des lectures qui n’extraient qu’une fraction des informations que les organoïdes pourraient potentiellement fournir. Il est devenu de plus en plus clair que, pour que la technologie organoïde en évolution rapide réalise un plus grand potentiel scientifique et clinique, des tests 3D, des lectures et des méthodes d’analyse plus avancés sont absolument nécessaires. Ici, un pipeline de criblage avancé est décrit, ce qui non seulement augmente la reproductibilité, mais améliore également considérablement la translatabilité clinique en intégrant une lecture d’imagerie de cellules vivantes pilotée par l’IA. En plus du logiciel d’analyse développé à l’interne, l’utilisation de la mesure de réponse normalisée aux médicaments (NDR) est mise en œuvre, ce qui démontre clairement sa capacité à définir les différences spécifiques au patient dans la réponse au traitement6.
L’inclusion de cette mesure de normalisation sera sans aucun doute d’une valeur considérable, si l’on se souvient que de nombreuses études visent à délimiter les réponses au traitement en fonction de différences mineures d’aire sous la courbe (ASC) ou de concentration inhibitrice demi-maximale (IC50) (car la plupart des courbes dose-réponse se chevauchent/sont situées à proximité les unes des autres)11,12 . Des mesures du taux de croissance ont déjà été mises en œuvre dans des protocoles de criblage de médicaments organoïdes utilisant le test basé sur l’ATP, mais reposent sur la normalisation des puits de référence lysés au point temporel 04. En revanche, cette méthode permet la normalisation du taux de croissance intrapuits, ce qui tient compte non seulement des différences interpatients dans le taux de croissance PDTO, mais aussi des différences entre puits résultant des variations de la densité de semis et des effets dépendants de l’emplacement des plaques pour augmenter la reproductibilité. De plus, nous avons adapté la NDR pour augmenter davantage la séparation de la réponse PDTO interpatiente en incluant un contrôle positif pour la normalisation 6,8.
En outre, l’analyse, qui est compatible avec les formats à haut débit et d’automatisation, peut détecter avec précision les réponses organoïdes individuelles, permettant de quantifier la résistance sous-clonale, la principale force motrice de la rechute et de la progression tumorales13. Par exemple, bien que PDAC052 et PDAC060 aient montré une bonne réponse au traitement in vitro (basée sur le NDR), l’analyse mono-organoïde supplémentaire a permis de détecter une petite population (plus grande population avec PDAC060) de sous-clones qui ne répondent pas au traitement. Fait intéressant, cela correspondait fortement à l’observation clinique, étant donné que PDAC052 et PDAC060 avaient une réponse durable (aucune activité tumorale détectée) mais ont finalement été diagnostiqués avec une progression tumorale locale (en raison de la présence de clones résistants). Par rapport aux lectures 3D conventionnelles (test basé sur l’ATP et taille/nombre), ce pipeline de dépistage avancé devrait augmenter les performances prédictives en extrayant des informations plus pertinentes sur le plan clinique de ces « patients en laboratoire ». Cette hypothèse est actuellement testée en criblant des échantillons cliniques PDTO dans le laboratoire des auteurs avec cette méthode pour corréler ex vivo avec la réponse in vivo et les résultats cliniques.
Pour mieux comprendre les mécanismes d’une réponse aux médicaments, les réactifs d’imagerie de cellules vivantes fluorescentes conventionnels, en plus des colorants de cytotoxicité, sont compatibles avec cette méthode pour étudier les mécanismes de la mort cellulaire. Nous avons précédemment montré la compatibilité de cette méthode avec le réactif vert Sartorius Caspase 3/7 pour étudier l’induction de l’apoptose dépendante de la caspase après un traitement au cisplatine8. La compatibilité avec d’autres colorants pour étudier le stress oxydatif (réactifs CellROX) ou l’hypoxie (réactifs Image-iT Hypoxia) reste à tester. Cependant, ces réactifs ont déjà été utilisés avec succès dans des modèles in vitro 3D14,15.
Le logiciel d’analyse d’images est également compatible avec d’autres formats de plaques ou méthodes de culture (par exemple, plaques à microcavités, dômes ECM) si des images claires et nettes des organoïdes peuvent être capturées. Ceci est souvent difficile pour les organoïdes cultivés dans des dômes car ils poussent dans différents plans z, ce qui nécessite une fonctionnalité d’empilement z du microscope qui n’est pas toujours disponible. Par conséquent, nous conseillons l’utilisation de microplaques ULA 384 puits à fond plat pour garantir des images de qualité suffisante.
De plus, l’analyse est compatible avec d’autres systèmes d’imagerie de cellules vivantes, comme indiqué précédemment pour les images à contraste de phase capturées avec un système IncuCyte ZOOM8. Une limitation du système d’imagerie de cellules vivantes Spark Cyto qui a été utilisé dans ce manuscrit est la capacité d’une plaque pour les mesures cinétiques. Cependant, l’extension Spark Motion augmente sa capacité jusqu’à 40 microplaques qui peuvent être criblées en vrac. La compatibilité du logiciel développé en interne sera étendue à ces systèmes et à d’autres afin d’offrir une solution indépendante de la plate-forme, dans le but de normaliser et d’automatiser les pipelines d’analyse d’images et de données. L’application Web comprendra également des outils graphiques interactifs et des calculs automatisés de mesures des médicaments, comme le montre le présent document, afin de réduire le temps d’analyse manuelle.
L’algorithme de segmentation PDTO sans marquage a été formé et testé sur divers modèles sphéroïdes et PDTO cultivés en interne avec des différences morphologiques distinctes (solide, semi-solide, kystique), et peut par conséquent les détecter avec une grande précision8. Une limite du modèle est que l’inclusion de PDTO kystiques a augmenté la détection indésirable des bulles présentes dans le puits suivant l’ensemencement. Cependant, l’incubation nocturne a été suffisante pour éliminer la plupart de ces bulles, permettant un balayage qualitatif du point de temps 0. La précision de la segmentation de l’image organoïde et de la méthode doit être validée par d’autres utilisateurs, et en fonction de leurs commentaires, le logiciel peut être formé davantage pour obtenir un algorithme d’analyse d’image robuste et automatisé. En outre, nous visons à obtenir plus de données cliniques pour corréler la réponse ex vivo au médicament quantifiée par cette méthode à la réponse clinique chez le patient afin d’identifier les meilleurs paramètres pour prédire la réponse thérapeutique et de développer davantage cette méthode pour la médecine fonctionnelle de précision du cancer16.
The authors have nothing to disclose.
Une partie de cette recherche a été financée par des dons de différents donateurs, dont Dedert Schilde vzw et M. Willy Floren. Ce travail est partiellement financé par la Fondation flamande pour la recherche, 12S9221N (A.L.), G044420N (S.V., A.L., E.G), 1S27021N (M.L), et par le Fonds de recherche industrielle de l’Université d’Anvers, PS ID 45151 (S.V., A.L., C.D.). La figure 1 a été créée avec BioRender.com.
6-well plate | Greiner | 657160 | |
8-Channel p300 (GEN 2) pipette | Opentrons | ||
300 µL Tips | Opentrons | ||
384-well flat-bottom ULA microplate | Corning | 4588 | minimum volume 50 µL |
384-well flat-bottom ULA Phenoplate | Perkin Elmer | 6057802 | minimum volume 75 µL |
A8301 | Tocris Bioscience | 2939 | |
ADF+++ | Advanced DMEM/F12, 1% GlutaMAX, 1% HEPES, 1% penicillin/streptomycin | ||
Advanced DMEM/F-12 | ThermoFisher Scientific | 12634 | |
B27 | ThermoFisher Scientific | 17504044 | |
Breathe easy sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z380059 | |
Caspase 3/7 Green | Sartorius | 4440 | |
Cell Counting Slides for TC10/TC20 | Bio-Rad Laboratories | 1450017 | |
CellTiter-Glo 3D | Promega | G9681 | ATP-assay |
Cooler for 25 mL reservoir | VWR (Diversified Biotech) | 490006-908 | |
Cooling element 12 x 8 x 3 cm | Bol.com | 9200000107744702 | For custom microplate holder OT-2 |
Cultrex Organoid Harvesting Solution | R&D systems | 3700-100-01 | |
Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2 | R&D systems | 3533-010-02 | extracellular matrix (ECM) |
Cytotox Green | Sartorius | 4633 | |
Cytotox Red | Sartorius | 4632 | |
D300e | Tecan | Digital drug dispenser | |
D300e Control v3.3.5 | Tecan | Control software D300e | |
FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
Full Medium | ADF+++ supplemented with 0.5 nM WNT surrogate-Fc-Fusion protein, 4% Noggin-Fc Fusion Protein conditioned medium, 4% Rpso3-Fc Fusion Protein conditioned medium, 1x B27, 1 mM N-acetyl cysteine (NAC), 5 mM nicotinamide, 500 nM A83-01, 100 ng/mL FGF10, and 10 nM Gastrin | ||
Gastrin | Sigma-Aldrich | G9145 | |
Gemcitabine | Selleck Chemicals | S1714 | |
GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 35050 | |
HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630056 | |
Hoechst 33342 Solution (20 mM) | ThermoFisher Scientific | 62259 | |
Human pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) patient-derived organoids | Biobank@uza (Antwerp, Belgium; ID: BE71030031000; Belgian Virtual Tumorbank funded by the National Cancer Plan) | ||
N-acetyl-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-25G | |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | |
Noggin-Fc Fusion Protein conditioned medium | Immunoprecise | N002 | |
Opentrons App v6.0.1 | Opentrons | OT-2 control software | |
Opentrons Protocol Designer Tool | Opentrons | https://designer.opentrons.com/ | |
Orbits data compression tool | www.orbits-oncology.com or contact corresponding author | ||
Orbits image analysis webapp | University of Antwerp | www.orbits-oncology.com or contact corresponding author | |
OT-2 | Opentrons | Pipetting robot | |
Paclitaxel | Selleck Chemicals | S1150 | |
Pasteur Pipette 230 mm | Novolab | A33696 | |
Peniciline-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140 | |
Prism 9 | GraphPad | ||
Rspo3-Fc Fusion Protein conditioned medium | Immunoprecise | N003 | |
Spark Cyto 600 | Tecan | Live-cell imaging and multi-mode platereader | |
SparkControl v3.1 | Tecan | Spark Cyto control software | |
Staurosporine | Tocris Bioscience | 1285 | |
Sterile 25 mL reservoir | VWR (Diversified Biotech) | 10141-922 | |
T8 plus cassette | Tecan | ||
TC20 | Bio-Rad Laboratories | automated cell counter | |
TrypLE | ThermoFisher Scientific | 12604-021 | dissociation enzyme |
Tween-20 | Acros Organics | 233360010 | |
WNT Surrogate-Fc-Fusion protein | Immunoprecise | N001 | |
Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 |