Ett optimerat protokoll presenteras som möjliggör utarmning av cytoplasmatiska mikrotubuliorganiserande centra i musoocyter under metafas I med hjälp av en nära infraröd femtosekundlaser.
Troheten hos oocytmeios är avgörande för att generera utvecklingskompetenta euploida ägg. Hos däggdjur genomgår äggcellen en lång arrestering vid profas I av den första meiotiska uppdelningen. Efter puberteten och vid meiotisk återupptagning demonteras kärnmembranet (kärnhöljets nedbrytning) och spindeln monteras huvudsakligen vid oocytcentret. Initial central spindelpositionering är avgörande för att skydda mot onormala kinetokore-mikrotubuli (MT) -fästen och aneuploidi. Den centralt placerade spindeln migrerar på ett tidskänsligt sätt mot cortex, och detta är en nödvändig process för att extrudera en liten polär kropp. I mitotiska celler är spindelpositionering beroende av interaktionen mellan centrosommedierade astrala MT och cellcortexen. Tvärtom saknar musoocyter klassiska centrosomer och innehåller istället många acentriolära MT-organiseringscentra (MTOC). I metafas I-stadiet har musoocyter två olika uppsättningar MTOC: er: (1) MTOC som är grupperade och sorterade för att montera spindelpoler (polära MTOC) och (2) metafas cytoplasmatiska MTOC (mcMTOC) som förblir i cytoplasman och inte bidrar direkt till spindelbildning men spelar en avgörande roll för att reglera spindelpositionering och snabb spindelmigration. Här beskrivs en multifotonlaserablationsmetod för att selektivt tömma endogent märkta mcMTOC i oocyter som samlats in från Cep192-eGfp-reportermöss . Denna metod bidrar till förståelsen av de molekylära mekanismer som ligger till grund för spindelpositionering och migration i däggdjurs oocyter.
Haploida könsceller (spermier och äggceller) produceras genom meios, vilket innebär en omgång DNA-replikation följt av två på varandra följande uppdelningar som är nödvändiga för kromosomantalsminskning före befruktning. Hos däggdjur, under tidigt fosterliv, genomgår oocyten en lång arrestering (fram till puberteten) vid diplotenstadiet av profas I i den första meiotiska uppdelningen, ett stadium som kallas germinal vesikel (GV) -stadiet. Efter meiotisk återupptagande genomgår GV-oocyten kärnhöljesnedbrytning (NEBD) och spindeln monteras huvudsakligen vid oocytcentret 1,2,3. Senare, driven av F-aktin, migrerar spindeln i rätt tid från oocytcentret till cortex för att säkerställa mycket asymmetrisk uppdelning, vilket resulterar i ett ägg med en liten polär kropp (PB) 4,5,6.
I mitotiska celler består centrosomerna av ett par centrioler omgivna av peri-centriolära materialkomponenter (PMC), såsom pericentrin, γ-tubulin, Cep152 och Cep1927. Dessa centriolhaltiga centrosomer bidrar till troheten hos bipolär spindelbildning8. Centrioler förloras emellertid under tidig oogenes hos olika arter, inklusive gnagare9. Därför antar musoocyter en centrioloberoende spindelmonteringsväg med hjälp av många acentriolära mikrotubuli (MT) organiseringscentra (MTOC)9,10. Vid meiotisk återupptagning genomgår de perinukleära MTOC: erna tre distinkta steg av återkondensation, sträckning och fragmentering i ett stort antal mindre MTOC11,12. De fragmenterade MTOC:erna grupperas sedan och sorteras för att organisera en bipolär spindel10,13,14. En annan pool av MTOC finns i cytoplasman under NEBD. Några av dessa cytoplasmatiska MTOC migrerar och bildar spindelpoler (polära MTOC, pMTOC)10,11. Nyligen upptäcktes en annan delmängd av cytoplasmatiska MTOC, kallade metafascytoplasmatiska MTOC (mcMTOC), som inte bidrar till spindelpolbildning men förblir i oocytcytoplasman under metafas I (Met I)15. Utarmning av mcMTOC genom laserablation med flera fotoner eller onormalt ökande antal genom autofagihämning stör spindelpositionering och migration och ökar förekomsten av aneuploidi i metafas II-oocyter15.
Intressant nog skiljer sig mcMTOC från pMTOC i många aspekter15. Till exempel, i motsats till pMTOC, som huvudsakligen härrör från perinukleära MTOC, härstammar mcMTOC från oocytcortexen. När spindeln fortfarande är i oocytcentret är mcMTOC: erna lokaliserade asymmetriskt motsatta den sida till vilken spindeln migrerar för PB-extrudering15. Astralliknande MT kan inte nå cortex i den relativt stora äggcellen. Därför kärnar dessa mcMTOCs MTs för att förankra spindeln (via astralliknande MTOC) till cortex. Dessa fynd tyder på en modell där den mcMTOC-kärnbildade MT-kraften motverkar den F-aktinmedierade kraften som driver spindelmigration mot cortex. Balansen mellan dessa två motsatta krafter är avgörande för att reglera den centrala spindelpositioneringen och snabb spindelmigration15.
Hittills lokaliseras alla undersökta PMC-proteiner (pericentrin, g-tubulin, Cep192 och Aurora-kinas A) till båda MTOC-poolerna: mcMTOC och pMTOCs15. Därför finns det inget kemiskt eller genetiskt tillvägagångssätt för att selektivt störa mcMTOC utan störande pMTOC. Dessa begränsningar kan kringgås genom att selektivt rikta in sig på mcMTOC med laserablation. Bland de laserbaserade tekniker som utvecklats för mikroablation visar pulserade femtosekundlasrar med flera foton stor potential på grund av deras precisionspåverkan begränsad till fokalplanet, det höga penetrationsdjupet för nära infrarött ljus och den minskade fototoxiciteten och termiska skadorna på cellen16,17,18. Detta arbete beskriver ett selektivt tillvägagångssätt för att ablatera mcMTOC i musoocyter med hjälp av en multifotonlaser kopplad till ett inverterat mikroskop.
Det finns olika metoder för att störa de cytoskelettrelaterade strukturerna i cellerna22,23,24,25. Att hitta effektiva tekniker för att selektivt störa den riktade strukturen utan att kompromissa med cellens livskraft är dock utmanande. Multifotonlaserablationsmetoden som presenteras här är en effektiv strategi för att inducera en selektiv mekanisk störning till mcMTOC i äggcellen utan att ändra oocytens livskraft.
Laserablation har använts i stor utsträckning för att förstå de molekylära mekanismerna som styr kromosomsegregering under mitos och meios22,23,26,27. På grund av den relativt stora storleken (>80 mm i diameter) av däggdjurs oocyter jämfört med somatiska celler28, representerar ablationen av deras intracellulära strukturer en utmaning. Dessutom är den genomsnittliga mcMTOC-volymen i metafas I-oocyter ~ 20 μm15, vilket representerar en ytterligare utmaning. En effektiv metod som erbjuder djupare vävnadspenetration måste antas för att övervinna dessa utmaningar. Den största fördelen med att använda multifotonlasern för ablation är dess förmåga att nå djupare in i cellen samtidigt som effekterna utanför målet minimeras29.
För att verifiera effekten och effektiviteten hos laserablationsmetoden för att tömma den riktade strukturen rekommenderas att man använder ett fluorescerande märkt protein för att identifiera den riktade strukturen över tid (före och efter ablation)23. Det är viktigt att notera att laserablation utarmar hela mcMTOC som en struktur, och även om mindre mcMTOC endast kräver att en enda laserexponering utarmas, kan större mcMTOC kräva mer än en laserexponering vid olika fokalplan. Det rekommenderas också att fixera och immunmärka en delmängd av kontroll- och mcMTOC-ablerade oocyter med en MTOC-markör (såsom γ-tubulin, pericentrisk eller Cep192) för att bekräfta effektiviteten hos mcMTOC-ablationen ytterligare. I kontrolloocyter kommer områden av cytoplasman precis intill men inte överlappande med mcMTOC att exponeras för lasern.
Detta experiment kräver flera mcMTOC-ablationer medan de rör sig mellan olika fokalplan i oocyterna. Därför rekommenderas det starkt att öva denna teknik flera gånger innan experimentet utförs för att minimera experimenttiden och därigenom öka oocytens livskraft. Dessutom är det viktigt att använda den minsta lasereffekten som är tillräcklig för att tömma mcMTOC utan att påverka oocytens livskraft.
Denna teknik har vissa begränsningar. För det första är konfokalmikroskop med flera foton relativt dyrare än vanliga konfokalmikroskop. För det andra är det mer tidskrävande att störa alla mcMTOC vid olika fokalplan än kemiska eller genetiska störningar. För det tredje kräver detta protokoll tekniska färdigheter för att ablatera alla mcMTOC på kortast möjliga tid. Men när den väl behärskas ger användningen av multifotonlasern en utmärkt strategi för att störa flera intracellulära strukturer i musoocyter, inklusive mcMTOC, vilket bidrar till förståelsen av molekylära mekanismer som reglerar spindelpositionering och dess snabba migration i däggdjurs oocyter.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka alla medlemmar i Balboula-laboratoriet för deras värdefulla hjälp och diskussioner. Författarna tackar Melina Schuh för att hon vänligt delade mCherry-Cep192-konstruktionen. Denna studie stöddes av R35GM142537 (NIGMS, NIH) till AZB.
4 IN thinwall GL 1.0 OD/.75 ID | World precision instrument | TW100F-4 | Injection needles |
Borosilicate glass | Fisherbrand | Cat# 13-678-20D | |
Borosilicate glass capillarities | World Precision Instrument | Cat# TW100-6 | Holding needles |
Bovine serum albumine | MilliporeSigma | Cat# A4503 | |
Cage incubator for Leica DMI6000 B microscope | Life Imaging Services GmbH | ||
Calcium chlrode dihydrate | MilliporeSigma | Cat# C7902 | |
CO2 controller | Pecon | # 0506.000 | |
CO2 Cover HP | Pecon | # 0506.020 | |
DL-Lactic acid | MilliporeSigma | Cat# L7900 | |
DMi8 | Leica | N/A | Microscope |
EDTA | MilliporeSigma | Cat# E5134 | |
Femtojet 4i | Eppendorf | N/A | Microinjector |
Femtotips Microloader | Fisher scientific | E5242956003 | |
Gentamicin | MilliporeSigma | Cat# G1272 | |
Gentamycin | MilliporeSigma | Cat# 1272 | |
Glass bottom dish | Mat Tek Corporation | Cat# P35G-1.0-20-C | |
Hepes | MilliporeSigma | Cat# H3784 | |
Hepes Sodium Salt | MilliporeSigma | Cat # H3784 | |
Hera Cell vios 160i | Thermo | N/A | CO2 incubator |
Leica TCP SP8 spectral laser scanning confocal micorscope with inverted stand DMI6000 B | Leica Microsystems, Inc | N/A | |
L-Glutamine | MilliporeSigma | Cat#G8540 | |
Magnesium sulfate dihydrate | MilliporeSigma | Cat# M7774 | |
MaiTai DeepSee Ti-Sapphire femtosecond laser | Spectra-Physics | N/A | |
mCH-Cep192 cRNA | N/A | ||
Medium Essential Medium Eagle – MEM | MilliporeSigma | Cat #M0258 | |
Milrinone | MilliporeSigma | Cat# M4659 | |
Mineral oil | MilliporeSigma | Cat# M5310 | |
Minimum essential medium eagle (MEM) | MilliporeSigma | Cat# M0268 – 1L | |
Mouse: Cep192-eGFP reporter CF-1 | N/A | ||
Petri dish (100 mm) | Fisherbrand | Cat# FB0875712 | |
Petri dish (35 mm) | Corning | Cat# 430165 | |
Petri dish (60 mm) | Falcon | Cat# 351007 | |
Phenol Red | MilliporeSigma | Cat# P5530 | |
Polyvinylpyrolidone | MilliporeSigma | Cat# P2307 | |
Polyvinylpyrolidone (PVP) | MilliporeSigma | Cat# P2307 | |
Potassium chloride | MilliporeSigma | Cat# P5405 | |
Potassium phosphate monobasic | MilliporeSigma | Cat# P5655 | |
Pregnant mare´s serum gonadotropin | Lee BioSolutions | Cat# 493-10-10 | |
Pyruvic acid | MilliporeSigma | Cat# P4562 | |
Pyruvic acid | MilliporeSigma | Cat# P4562 | |
Sewing needles | D.M.C | N/A | N° 5 * 16 Needles |
Sodium bicarbonate | MilliporeSigma | Cat# S5761 | |
Sodium chloride | MilliporeSigma | Cat# S5886 | |
Stage-top heating insert P | Pecon | # 0426.300 | |
Sterezoom S9i | Leica | N/A | Stereomicroscope |
Syringe 1 mL | BD company | Cat# 309597 | |
Taurine | MilliporeSigma | Cat# T0625 | |
Temperature controller Tempcontrol 37-2 digital | Pecon | # 0503.000 | |
The Cube temperature controller for the cage incubator | Life Imaging Services GmbH |