Établissement d’organoïdes endométriaux 3D à partir de l’utérus de souris

Summary

Ce protocole décrit des méthodologies pour établir des organoïdes épithéliaux de l’endomètre de souris pour l’expression génique et les analyses histologiques.

Abstract

Le tissu endométrial tapisse la cavité interne de l’utérus et est sous le contrôle cyclique de l’œstrogène et de la progestérone. C’est un tissu composé d’épithélium luminal et glandulaire, d’un compartiment stromal, d’un réseau vasculaire et d’une population complexe de cellules immunitaires. Les modèles murins ont été un outil puissant pour étudier l’endomètre, révélant des mécanismes critiques qui contrôlent l’implantation, la placentation et le cancer. Le développement récent de cultures organoïdes endométriales 3D présente un modèle de pointe pour disséquer les voies de signalisation qui sous-tendent la biologie de l’endomètre. L’établissement d’organoïdes endométriaux à partir de modèles de souris génétiquement modifiés, l’analyse de leurs transcriptomes et la visualisation de leur morphologie à une résolution unicellulaire sont des outils cruciaux pour l’étude des maladies de l’endomètre. Cet article décrit les méthodes permettant d’établir des cultures 3D d’épithélium endométrial à partir de souris et décrit des techniques pour quantifier l’expression des gènes et analyser l’histologie des organoïdes. L’objectif est de fournir une ressource qui peut être utilisée pour établir, cultiver et étudier l’expression génique et les caractéristiques morphologiques des organoïdes épithéliaux de l’endomètre.

Introduction

L’endomètre – le tissu muqueux interne de la muqueuse de la cavité utérine – est un tissu unique et très dynamique qui joue un rôle essentiel dans la santé reproductive d’une femme. Au cours de la vie reproductive, l’endomètre a le potentiel de subir des centaines de cycles de prolifération, de différenciation et de dégradation, coordonnés par l’action concertée des hormones ovariennes – œstrogènes et progestérone. Des études sur des souris génétiquement modifiées ont révélé des mécanismes biologiques de base qui sous-tendent la réponse endométriale aux hormones et le contrôle de l’implantation des embryons, de la décidualisation des cellules stromales et de la grossesse¹. Les études in vitro, cependant, ont été limitées en raison des difficultés à maintenir les tissus primaires de l’endomètre de souris non transformés dans les cultures cellulaires 2D traditionnelles ^2,3. Les progrès récents dans la culture de tissus endométriaux en tant que systèmes d’organes 3D, ou organoïdes, présentent une nouvelle opportunité d’étudier les voies biologiques qui contrôlent la régénération et la différenciation des cellules endométriales. Des systèmes organoïdes de l’endomètre de souris et d’homme ont été développés à partir d’épithélium endométrial pur encapsulé dans diverses matrices^4,5, tandis que l’endomètre humain a été cultivé sous forme de co-cultures épithéliales/stromales sans échafaudage^6,7, et plus récemment sous forme d’assemblages épithéliaux/stromaux encapsulés dans du collagène⁸ . Le potentiel de croissance et de régénération des cultures organoïdes épithéliales est soutenu par un cocktail défini de facteurs de croissance et d’inhibiteurs de petites molécules qui ont été déterminés empiriquement pour maximiser la croissance et la régénération des organoïdes ^4,5,9. De plus, la capacité de congeler et de décongeler les organoïdes de l’endomètre permet la mise en banque à long terme d’organoïdes endométriaux provenant de souris et d’humains pour des études futures.

Des souris génétiquement modifiées ont révélé les voies de signalisation complexes qui contrôlent la grossesse précoce et la décidualisation, et ont été utilisées comme modèles de perte de grossesse, de cancer de l’endomètre et d’endométriose. Ces études génétiques ont été réalisées en grande partie avec la délétion spécifique à la cellule des allèles flanqués de loxP (« floxed ») en utilisant des recombinases cre qui sont spécifiquement actives dans les tissus reproducteurs femelles. Ces modèles murins comprennent le récepteur de progestérone-cre 10 largement utilisé, qui a une forte activité de recombinase dans les tissus épithéliaux et stromaux de l’endomètre, la lactoferrine i-cre, qui induit la recombinaison épithéliale de l’endomètre chez les souris adultes¹¹, ou Wnt7a-cre, qui déclenche une délétion épithéliale spécifique dans les tissus dérivés de Müller¹² . La culture de tissus endométriaux à partir de modèles de souris génétiquement modifiés en tant qu’organoïdes 3D a fourni une excellente occasion d’étudier la biologie de l’endomètre et de faciliter l’identification des facteurs de croissance et des voies de signalisation qui contrôlent le renouvellement et la différenciation des cellules endométriales^13,14. Les méthodes d’isolement et de culture du tissu endométrial de souris sont décrites dans la littérature et rapportent l’utilisation de diverses stratégies enzymatiques pour l’isolement de l’épithélium utérin pour la culture ultérieure d’organoïdes épithéliaux de l’endomètre⁴. Alors que la littérature précédente fournit un cadre critique pour les protocoles de culture organoïde épithéliale de l’endomètre ^4,5,6, cet article fournit une méthode claire et complète pour générer^, maintenir, traiter et analyser ces organoïdes. La normalisation de ces techniques est importante pour accélérer les progrès dans le domaine de la biologie de la reproduction des femmes. Ici, nous rapportons une méthodologie détaillée pour la purification enzymatique et mécanique du tissu épithélial de l’endomètre de souris pour la culture ultérieure d’organoïdes de l’endomètre dans un échafaudage à matrice de gel. Nous décrivons également les méthodologies pour les analyses histologiques et moléculaires en aval des organoïdes épithéliaux de l’endomètre de souris encapsulés dans la matrice de gel.

Protocol

La manipulation de souris et les études expérimentales ont été réalisées conformément aux protocoles approuvés par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) du Baylor College of Medicine et aux lignes directrices établies par le Guide des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. 1. Isolement de l’épithélium utérin de souris à l’aide de méthodes enzymatiques et mécaniques REMARQUE…

Representative Results

Images à contraste de phase d’organoïdes endométriaux de sourisNous avons établi des organoïdes à partir de l’épithélium de l’endomètre de souris WT, comme décrit dans le protocole ci-joint (voir schéma de la figure 1). Après la dissociation enzymatique de l’épithélium de l’endomètre de souris, les feuillets épithéliaux ont été séparés mécaniquement des cellules stromales utérines et dissociés avec la collagénase pour générer une susp…

Discussion

Ici, nous décrivons les méthodes pour générer des organoïdes épithéliaux de l’endomètre de l’endomètre de souris et les protocoles couramment utilisés pour leur analyse en aval. Les organoïdes de l’endomètre sont un outil puissant pour étudier les mécanismes qui contrôlent les maladies liées à l’endomètre, telles que l’endométriose, le cancer de l’endomètre et l’échec de l’implantation. Des études marquantes publiées en 2017 ont rapporté les conditions de culture à long terme et r…

Materials

Organoid Media Formulation
Name	Company	Catalog Number	Final concentration
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-free	Corning	354230	100%
Trypsin from Bovine Pancreas	Sigma Aldrich	T1426-1G	1%
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634010	1X
N2 supplement	Life Technologies	17502048	1X
B-27™ Supplement (50X), minus vitamin A	Life Technologies	12587010	1X
Primocin	Invivogen	ant-pm-1	100 µg/mL
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma Aldrich	A9165-5G	1.25 mM
L-glutamine	Life Technologies	25030024	2 mM
Nicotinamide	Sigma Aldrich	N0636-100G	10 nM
ALK-4, -5, -7 inhibitor, A83-01	Tocris	2939	500 nM
Recombinant human EGF	Peprotech	AF-100-15	50 ng/mL
Recombinant human Noggin	Peprotech	120-10C	100 ng/mL
Recombinant human Rspondin-1	Peprotech	120-38	500 ng/mL
Recombinant human FGF-10	Peprotech	100-26	100 ng/mL
Recombinant human HGF	Peprotech	100-39	50 ng/mL
WNT3a	R&D systems	5036-WN	200 ng/mL
Other supplies and reagents
Name	Company	Catalog Number	Final concentration
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma Aldrich	C0130-1G	5 mg/mL
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma Aldrich	DN25-100MG	2 mg/mL
DPBS, no calcium, no magnesium	ThermoFisher	14190-250	1X
HBSS, no calcium, no magnesium	ThermoFisher	14170112	1X
Falcon Polystyrene Microplates (24-Well)	Fisher Scientific	#08-772-51
Falcon Polystyrene Microplates (12-Well)	Fisher Scientific	#0877229
Falcon Cell Strainers, 40 µm	Fisher Scientific	#08-771-1
Direct-zol RNA MiniPrep (50 µg)	Genesee Scientific	11-331
Trizol reagent	Invitrogen	15596026
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red	ThermoFisher	11039021
Fetal Bovine Serum, Charcoal stripped	Sigma Aldrich	F6765-500ML	2%
Estratiol (E2)	Sigma Aldrich	E1024-1G	10 nM
Formaldehyde 16% in aqueous solution, EM Grade	VWR	15710	4%
Epredia Cassette 1 Slotted Tissue Cassettes	Fisher Scientific	1000961
Epredia Stainless-Steel Embedding Base Molds	Fisher Scientific	64-010-15
Ethanol, 200 proof (100%)	Fisher Scientific	22-032-601
Histoclear	Fisher Scientific	50-899-90147
Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	50-277-97
Epredia Nylon Biopsy Bags	Fisher Scientific	6774010
HistoGel Specimen Processing Gel	VWR	83009-992
Hematoxylin solution Premium	VWR	95057-844
Eosin Y (yellowish) solution Premium	VWR	95057-848
TBS Buffer, 20X, pH 7.4	GenDEPORT	T8054	1X
TBST (10X), pH 7.4	GenDEPORT	T8056	1X
Citric acid	Sigma Aldrich	C0759-1KG
Sodium citrate tribasic dihydrate	Sigma Aldrich	S4641-500G
Tween20	Fisher Scientific	BP337-500
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A2153-100G	3%
DAPI Solution (1 mg/mL)	ThermoFisher	62248	1:1000 dilution
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	Vector Labs	H-1000-10
Clear Nail Polish	Fisher Scientific	NC1849418
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	22037246
VWR Micro Cover Glasses	VWR	48393-106
SuperScript VILO Master Mix	ThermoFisher	11755050
SYBR Green PCR Master Mix	ThermoFisher	4364346
Krt8 Antibody (TROMA-I)	DSHB	TROMA-I	1:50 dilution
Vimentin Antobody	Cell Signaling	5741S	1:200 dilution
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594	ThermoFisher	A-21209	1:250 dilution
Donkey anti-Rabbin IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher	A-21206	1:250 dilution
ZEISS Stemi 508 Stereo Microscope	ZEISS
ZEISS Axio Vert.A1 Inverted Routine Microscope with digital camera	ZEISS
Primer Sequence	Forward (5'-3')	Reverse (5'-3')	_
Lipocalin 2 (Lcn2)	GCAGGTGGTACGTTGTGGG	CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC
Lactoferrin (Ltf)	TGAGGCCCTTGGACTCTGT	ACCCACTTTTCTCATCTCGTTC
Progesterone (Pgr)	CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC	TAACTTCAGACATCATTTCCGG
Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase (Gapdh)	CAATGTGTCCGTCGTGGATCT	GCCTGCTTCACCACCTTCTT