यह प्रोटोकॉल जीन अभिव्यक्ति और हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए माउस एंडोमेट्रियल उपकला ऑर्गेनोइड ्स स्थापित करने के तरीकों का वर्णन करता है।
एंडोमेट्रियल ऊतक गर्भाशय की आंतरिक गुहा को रेखाबद्ध करता है और एस्ट्रोजेन और प्रोजेस्टेरोन के चक्रीय नियंत्रण में होता है। यह एक ऊतक है जो ल्यूमिनल और ग्रंथियों के उपकला, एक स्ट्रोमल डिब्बे, एक संवहनी नेटवर्क और एक जटिल प्रतिरक्षा कोशिका आबादी से बना है। माउस मॉडल एंडोमेट्रियम का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण रहा है, जो महत्वपूर्ण तंत्र का खुलासा करता है जो आरोपण, प्लेसेंटा और कैंसर को नियंत्रित करता है। 3 डी एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड संस्कृतियों का हालिया विकास एंडोमेट्रियल जीव विज्ञान के तहत आने वाले सिग्नलिंग मार्गों को विच्छेदित करने के लिए एक अत्याधुनिक मॉडल प्रस्तुत करता है। आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल से एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड्स की स्थापना, उनके ट्रांसस्क्रिप्टम का विश्लेषण करना, और एकल-कोशिका संकल्प पर उनकी आकृति विज्ञान की कल्पना करना एंडोमेट्रियल रोगों के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण उपकरण हैं। यह पेपर चूहों से एंडोमेट्रियल एपिथेलियम की 3 डी संस्कृतियों को स्थापित करने के तरीकों को रेखांकित करता है और जीन अभिव्यक्ति को मापने और ऑर्गेनोइड्स के ऊतक विज्ञान का विश्लेषण करने के लिए तकनीकों का वर्णन करता है। लक्ष्य एक संसाधन प्रदान करना है जिसका उपयोग एंडोमेट्रियल उपकला ऑर्गेनोइड्स की जीन अभिव्यक्ति और रूपात्मक विशेषताओं को स्थापित करने, संस्कृति और अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।
एंडोमेट्रियम – गर्भाशय गुहा का आंतरिक अस्तर म्यूकोसल ऊतक – एक अद्वितीय और अत्यधिक गतिशील ऊतक है जो एक महिला के प्रजनन स्वास्थ्य में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। प्रजनन जीवनकाल के दौरान, एंडोमेट्रियम प्रसार, भेदभाव और टूटने के सैकड़ों चक्रों से गुजरने की क्षमता रखता है, जो डिम्बग्रंथि हार्मोन – एस्ट्रोजन और प्रोजेस्टेरोन की ठोस कार्रवाई द्वारा समन्वित होता है। आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों के अध्ययन ने हार्मोन के लिए एंडोमेट्रियल प्रतिक्रिया और भ्रूण प्रत्यारोपण, स्ट्रोमल सेल निर्णय और गर्भावस्था के नियंत्रण को रेखांकित करने वाले बुनियादी जैविक तंत्रको उजागर किया है। हालांकि, पारंपरिक 2 डी सेल संस्कृतियों 2,3 में गैर-रूपांतरित प्राथमिक माउस एंडोमेट्रियल ऊतकों को बनाए रखने में कठिनाइयोंके कारण इन विट्रो अध्ययन सीमित हैं। 3 डी अंग प्रणाली, या ऑर्गेनोइड्स के रूप में एंडोमेट्रियल ऊतकों की संस्कृति में हालिया प्रगति, जैविक मार्गों की जांच करने का एक नया अवसर प्रस्तुत करती है जो एंडोमेट्रियल सेल पुनर्जनन और भेदभाव को नियंत्रित करते हैं। माउस और मानव एंडोमेट्रियल ऑर्गेनॉइड सिस्टम को शुद्ध एंडोमेट्रियल एपिथेलियम से विभिन्न मैट्रिक्स 4,5 में समझाया गया है, जबकि मानव एंडोमेट्रियम को पाड़-मुक्त उपकला / स्ट्रोमल सह-संस्कृतियों 6,7 के रूप में सुसंस्कृत किया गया है, और हाल ही में कोलेजन-एनकैप्सुलेटेड एपिथेलियल / स्ट्रोमल असेंबलोइड्स8 के रूप में। . उपकला ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों की वृद्धि और पुनर्योजी क्षमता को विकास कारकों और छोटे अणु अवरोधकों के परिभाषित कॉकटेल द्वारा समर्थित किया जाता है जिन्हें ऑर्गेनोइड्स 4,5,9 के विकास और उत्थान को अधिकतम करने के लिए अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया गया है। इसके अलावा, एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड्स को फ्रीज करने और पिघलाने की क्षमता भविष्य के अध्ययनों के लिए चूहों और मनुष्यों से एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड्स की दीर्घकालिक बैंकिंग की अनुमति देती है।
आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों ने जटिल सिग्नलिंग मार्गों का खुलासा किया है जो प्रारंभिक गर्भावस्था और निर्णय को नियंत्रित करते हैं, और गर्भावस्था के नुकसान, एंडोमेट्रियल कैंसर और एंडोमेट्रियोसिस के मॉडल के रूप में उपयोग किया गया है। इन आनुवंशिक अध्ययनों को बड़े पैमाने पर महिला प्रजनन ऊतकों में सक्रिय क्रे रिकोम्बिनेस का उपयोग करके लोक्सपी फ्लैंक्ड एलील्स (“फ्लोक्स्ड”) के सेल-विशिष्ट विलोपन के साथ हासिल किया गया है। इन माउस मॉडल में व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला प्रोजेस्टेरोन रिसेप्टर-सीआरई10 शामिल है, जिसमें एंडोमेट्रियल उपकला और स्ट्रोमल ऊतकों में मजबूत रिकॉम्बिनेस गतिविधि होती है, लैक्टोफेरिन आई-क्रे, जो वयस्क चूहों11, या डब्ल्यूएनटी 7 ए-क्रे में एंडोमेट्रियल उपकला पुनर्संयोजन को प्रेरित करता है, जो मुलेरियन-व्युत्पन्न ऊतकों में उपकला-विशिष्ट विलोपन को ट्रिगर करता है। . आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल से एंडोमेट्रियल ऊतकों को 3 डी ऑर्गेनोइड्स के रूप में संवर्धन ने एंडोमेट्रियल जीव विज्ञान की जांच करने और एंडोमेट्रियल सेल नवीकरण और भेदभावको नियंत्रित करने वाले विकास कारकों और सिग्नलिंग मार्गों की पहचान की सुविधा प्रदान करने का एक उत्कृष्ट अवसर प्रदान किया है। माउस एंडोमेट्रियल ऊतक के अलगाव और संस्कृति के तरीकों को साहित्य में वर्णित किया गया है और एंडोमेट्रियल उपकलाऑर्गेनोइड्स के बाद के संवर्धन के लिए गर्भाशय उपकला के अलगाव के लिए विभिन्न एंजाइमैटिक रणनीतियों के उपयोग की रिपोर्ट करते हैं। जबकि पिछला साहित्य एंडोमेट्रियल उपकला ऑर्गेनॉइड संस्कृति प्रोटोकॉल 4,5,6 के लिए एक महत्वपूर्ण ढांचा प्रदान करता है, यह पेपर इन ऑर्गेनोइड्स को उत्पन्न करने, बनाए रखने, प्रसंस्करण और विश्लेषण करने के लिए एक स्पष्ट, व्यापक विधि प्रदान करता है। महिलाओं के प्रजनन जीव विज्ञान के क्षेत्र में प्रगति में तेजी लाने के लिए इन तकनीकों का मानकीकरण महत्वपूर्ण है। यहां, हम एक जेल मैट्रिक्स पाड़ में एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड्स की बाद की संस्कृति के लिए माउस एंडोमेट्रियल उपकला ऊतक के एंजाइमेटिक और यांत्रिक शुद्धिकरण के लिए एक विस्तृत पद्धति की रिपोर्ट करते हैं। हम जेल मैट्रिक्स-एनकैप्सुलेटेड माउस एंडोमेट्रियल एपिथेलियल ऑर्गेनोइड्स के डाउनस्ट्रीम हिस्टोलॉजिकल और आणविक विश्लेषण के लिए पद्धतियों का भी वर्णन करते हैं।
यहां, हम माउस एंडोमेट्रियम से एंडोमेट्रियल उपकला ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने के तरीकों का वर्णन करते हैं और प्रोटोकॉल नियमित रूप से उनके डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाते हैं। एंडोमेट्रियल ऑर्?…
The authors have nothing to disclose.
हम डॉ स्टेफ़नी पंगास और डॉ मार्टिन एम माटज़ुक (एमएमएम) को हमारी पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने और संपादन के लिए धन्यवाद देते हैं। अध्ययनों को यूनिस कैनेडी श्राइवर नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ चाइल्ड हेल्थ एंड ह्यूमन डेवलपमेंट अनुदान आर00-एचडी096057 (डीएम), आर01-एचडी105800 (डीएम), आर01-एचडी032067 (एमएमएम), और आर01-एचडी110038 (एमएमएम), और एनसीआई-पी 30 कैंसर सेंटर सपोर्ट ग्रांट (एनसीआई-सीए125123) द्वारा समर्थित किया गया था। डायना मोनसिवाइस, पीएचडी बरोज वेलकम फंड से नेक्स्ट जेन प्रेग्नेंसी अवार्ड रखती हैं।
Organoid Media Formulation | |||
Name | Company | Catalog Number | Final concentration |
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-free | Corning | 354230 | 100% |
Trypsin from Bovine Pancreas | Sigma Aldrich | T1426-1G | 1% |
Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634010 | 1X |
N2 supplement | Life Technologies | 17502048 | 1X |
B-27™ Supplement (50X), minus vitamin A | Life Technologies | 12587010 | 1X |
Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 100 µg/mL |
N-Acetyl-L-cysteine | Sigma Aldrich | A9165-5G | 1.25 mM |
L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | 2 mM |
Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636-100G | 10 nM |
ALK-4, -5, -7 inhibitor, A83-01 | Tocris | 2939 | 500 nM |
Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | 50 ng/mL |
Recombinant human Noggin | Peprotech | 120-10C | 100 ng/mL |
Recombinant human Rspondin-1 | Peprotech | 120-38 | 500 ng/mL |
Recombinant human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 100 ng/mL |
Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | 50 ng/mL |
WNT3a | R&D systems | 5036-WN | 200 ng/mL |
Other supplies and reagents | |||
Name | Company | Catalog Number | Final concentration |
Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C0130-1G | 5 mg/mL |
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | DN25-100MG | 2 mg/mL |
DPBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190-250 | 1X |
HBSS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14170112 | 1X |
Falcon Polystyrene Microplates (24-Well) | Fisher Scientific | #08-772-51 | |
Falcon Polystyrene Microplates (12-Well) | Fisher Scientific | #0877229 | |
Falcon Cell Strainers, 40 µm | Fisher Scientific | #08-771-1 | |
Direct-zol RNA MiniPrep (50 µg) | Genesee Scientific | 11-331 | |
Trizol reagent | Invitrogen | 15596026 | |
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red | ThermoFisher | 11039021 | |
Fetal Bovine Serum, Charcoal stripped | Sigma Aldrich | F6765-500ML | 2% |
Estratiol (E2) | Sigma Aldrich | E1024-1G | 10 nM |
Formaldehyde 16% in aqueous solution, EM Grade | VWR | 15710 | 4% |
Epredia Cassette 1 Slotted Tissue Cassettes | Fisher Scientific | 1000961 | |
Epredia Stainless-Steel Embedding Base Molds | Fisher Scientific | 64-010-15 | |
Ethanol, 200 proof (100%) | Fisher Scientific | 22-032-601 | |
Histoclear | Fisher Scientific | 50-899-90147 | |
Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | 50-277-97 | |
Epredia Nylon Biopsy Bags | Fisher Scientific | 6774010 | |
HistoGel Specimen Processing Gel | VWR | 83009-992 | |
Hematoxylin solution Premium | VWR | 95057-844 | |
Eosin Y (yellowish) solution Premium | VWR | 95057-848 | |
TBS Buffer, 20X, pH 7.4 | GenDEPORT | T8054 | 1X |
TBST (10X), pH 7.4 | GenDEPORT | T8056 | 1X |
Citric acid | Sigma Aldrich | C0759-1KG | |
Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | S4641-500G | |
Tween20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153-100G | 3% |
DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher | 62248 | 1:1000 dilution |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Labs | H-1000-10 | |
Clear Nail Polish | Fisher Scientific | NC1849418 | |
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 22037246 | |
VWR Micro Cover Glasses | VWR | 48393-106 | |
SuperScript VILO Master Mix | ThermoFisher | 11755050 | |
SYBR Green PCR Master Mix | ThermoFisher | 4364346 | |
Krt8 Antibody (TROMA-I) | DSHB | TROMA-I | 1:50 dilution |
Vimentin Antobody | Cell Signaling | 5741S | 1:200 dilution |
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 |
ThermoFisher | A-21209 | 1:250 dilution |
Donkey anti-Rabbin IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 |
ThermoFisher | A-21206 | 1:250 dilution |
ZEISS Stemi 508 Stereo Microscope | ZEISS | ||
ZEISS Axio Vert.A1 Inverted Routine Microscope with digital camera | ZEISS | ||
Primer Sequence | Forward (5'-3') | Reverse (5'-3') | _ |
Lipocalin 2 (Lcn2) | GCAGGTGGTACGTTGTGGG | CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC | |
Lactoferrin (Ltf) | TGAGGCCCTTGGACTCTGT | ACCCACTTTTCTCATCTCGTTC | |
Progesterone (Pgr) | CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC | TAACTTCAGACATCATTTCCGG | |
Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase (Gapdh) | CAATGTGTCCGTCGTGGATCT | GCCTGCTTCACCACCTTCTT |