Este protocolo descreve metodologias para estabelecer organoides epiteliais endometriais de camundongos para expressão gênica e análises histológicas.
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Artigo de método
Estabelecendo organoides endometriais 3D do útero do rato
Neste artigo
Resumo
Resumo
O tecido endometrial reveste a cavidade interna do útero e está sob o controle cíclico do estrogênio e da progesterona. É um tecido composto por epitélio luminal e glandular, um compartimento estromal, uma rede vascular e uma população complexa de células imunes. Modelos de camundongos têm sido uma ferramenta poderosa para estudar o endométrio, revelando mecanismos críticos que controlam a implantação, a placentação e o câncer. O recente desenvolvimento de culturas organoides endometriais 3D apresenta um modelo de última geração para dissecar as vias de sinalização subjacentes à biologia endometrial. Estabelecer organoides endometriais a partir de modelos de camundongos geneticamente modificados, analisar seus transcriptomas e visualizar sua morfologia em uma resolução de célula única são ferramentas cruciais para o estudo de doenças endometriais. Este artigo descreve métodos para estabelecer culturas 3D de epitélio endometrial de camundongos e descreve técnicas para quantificar a expressão gênica e analisar a histologia dos organoides. O objetivo é fornecer um recurso que possa ser usado para estabelecer, cultivar e estudar a expressão gênica e as características morfológicas dos organoides epiteliais endometriais.
Introdução
O endométrio - o tecido mucoso do revestimento interno da cavidade uterina - é um tecido único e altamente dinâmico que desempenha papéis críticos na saúde reprodutiva de uma mulher. Durante a vida reprodutiva, o endométrio tem o potencial de sofrer centenas de ciclos de proliferação, diferenciação e quebra, coordenados pela ação concertada dos hormônios ovarianos - estrogênio e progesterona. Estudos de camundongos geneticamente modificados descobriram mecanismos biológicos básicos que sustentam a resposta endometrial aos hormônios e o controle da implantação embrionária, a decidualização das células estromais e a gravidez1. Estudos in vitr....
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Protocolo
O manejo de camundongos e estudos experimentais foram realizados sob protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Baylor College of Medicine e diretrizes estabelecidas pelo NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.
1. Isolamento do epitélio uterino de camundongos usando métodos enzimáticos e mecânicos
NOTA: Esta seção descreve as etapas necessárias para estabelecer, passar, congelar e descongelar organoides endometriais epiteliais de camundongos usando um andaime de matriz de gel. Estudos anteriores determinaram que culturas ótimas de organoides....
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Resultados
Imagens de contraste de fase de organoides endometriais de camundongos
Estabelecemos organoides do epitélio endometrial de camundongos WT, conforme descrito no protocolo anexado (ver diagrama na Figura 1). Após a dissociação enzimática do epitélio endometrial do rato, as folhas epiteliais foram separadas mecanicamente das células estromais uterinas e posteriormente dissociadas com colagenase para gerar uma suspensão unicelular. Se realizado corretamente, este método de se.......
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Discussão
Aqui, descrevemos métodos para gerar organoides epiteliais endometriais a partir do endométrio de camundongos e os protocolos rotineiramente utilizados para sua análise a jusante. Os organoides endometriais são uma ferramenta poderosa para estudar os mecanismos que controlam doenças relacionadas ao endométrio, como endometriose, câncer de endométrio e falha de implantação. Estudos de referência publicados em 2017 relataram as condições para a cultura de culturas de longo prazo e renováveis de organoides endometriais de e.......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos à Dra. Stephanie Pangas e ao Dr. Martin M. Matzuk (M.M.M.) pela leitura crítica e edição do nosso manuscrito. Os estudos foram apoiados pelas bolsas R00-HD00-HD096057 (D.M.), R01-HD105800 (D.M.), R01-HD032067 (M.M.M.) e R01-HD110038 (M.M.M.), e pelo NCI-P30 Cancer Center Support Grant (NCI-CA125123). Diana Monsivais, Ph.D. possui um Prêmio de Gravidez de Próxima Geração do Burroughs Wellcome Fund.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Formulação de mídia organoide | |||
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Concentração final |
| Corning Matrigel Fator de crescimento reduzido (TFG) Matriz de membrana basal, *Corning | 354230 | 100% | |
| Tripsina do Pâncreas Bovino | Sigma Aldrich | T1426-1G | 1% |
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634010 | 1X |
| N2 suplemento | Life Technologies | 17502048 | 1X |
| B-27™ Suplemento (50X), menos vitamina A | Life Technologies | 12587010 | 1X |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 100 µ g / mL |
| N-Acetil-L-cisteína | Sigma Aldrich | A9165-5G | 1,25 mM |
| L-glutamina | Life Technologies | 25030024 | 2 mM |
| Nicotinamida | Sigma Aldrich | N0636-100G | 10 nM |
| ALK-4, -5, -7 inibidor, A83-01 | Tocris | 2939 | 500 nM |
| EGF humano recombinante | Peprotech | AF-100-15 | 50 ng / mL |
| Noggin humano recombinante | Peprotech | 120-10C | 100 ng/mL |
| Rspondin-1 humano recombinante | Peprotech | 120-38 | 500 ng/mL |
| Humano recombinante FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 100 ng/mL |
| HGF humano recombinante | Peprotech | 100-39 | 50 ng/mL |
| WNT3a | R& D systems | 5036-WN | 200 ng/mL |
| Outros suprimentos e reagentes | |||
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Concentração final |
| Colagenase de Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C0130-1G | 5 mg/ mL |
| de desoxirribonuclease I de pâncreas bovino | Sigma Aldrich | DN25-100MG | 2 mg/mL |
| DPBS, sem cálcio, sem magnésio | ThermoFisher | 14190-250 | 1X |
| HBSS, sem cálcio, sem magnésio | ThermoFisher | 14170112 | 1X |
| Falcon Microplacas de Poliestireno (24-Poços) | Fisher Scientific | #08-772-51 | |
| Falcon Microplacas de Poliestireno (12 Poços) | Fisher Scientific | #0877229 | |
| Filtros de Células Falcon, 40 µ m | Fisher Scientific | #08-771-1 | |
| MiniPrep de RNA Direto-zol (50 µ g) | Genesee Scientific | 11-331 | |
| Trizol reagente | Invitrogen | 15596026 | |
| DMEM / F-12, HEPES, sem vermelho de fenol | ThermoFisher | 11039021 | |
| soro bovino fetal, carvão vegetal descascado | Sigma Aldrich | F6765-500ML | 2% |
| Estratiol (E2) | Sigma Aldrich | E1024-1G | 10 nM |
| formaldeído 16% em aquoso solução, EM Grade | VWR | 15710 | 4% |
| Epredia 1 de Tecido Ranurado | Fisher Scientific | 1000961 | |
| Epredia Base de Encaixe em Aço Inoxidável Moldes | Fisher Scientific | 64-010-15 | |
| Etanol, 200 provas (100%) | Fisher Scientific | 22-032-601 | |
| Histoclear | Fisher Scientific | 50-899-90147 | |
| Permount Montagem Média | Fisher Scientific | 50-277-97 | |
| Bolsas de Biópsia de Nylon Epredia | Fisher Scientific | 6774010 | |
| HistoGel Gel de Processamento de Amostras | VWR | 83009-992 | |
| Solução de hematoxilina Premium | VWR | 95057-844 | |
| Solução de Eosina Y (amarelada) Premium | VWR | 95057-848 | |
| TBS Buffer, 20X, pH 7.4 | GenDEPORT | T8054 | 1X |
| TBST (10X), pH 7.4 | GenDEPORT | T8056 | 1X |
| Ácido cítrico | Sigma Aldrich | C0759-1KG | |
| Citrato de sódio tribásico dihidratado | Sigma Aldrich | S4641-500G | |
| Tween20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Albumina de soro bovino (BSA) | Sigma Aldrich | A2153-100G | 3% |
| DAPI Solução (1 mg/mL) | ThermoFisher | 62248 | diluição 1:1000 |
| VECTASHIELD Antifade Montagem Medium | Vector Labs | H-1000-10 | |
| Esmalte transparente | Fisher Scientific | NC1849418 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Lâminas de microscópio Fisher | Óculos | ||
| VWR | 48393-106 | ||
| SuperScript VILO Master Mix | ThermoFisher | 11755050 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | ThermoFisher | 4364346 | |
| Krt8 Antibody (TROMA-I) | DSHB | TROMA-I | Diluição 1:50 |
| Vimentina Antobody | Cell Signaling | 5741S | diluição 1:200 |
| Burro anti-Rato IgG (H+L) Anticorpo Secundário Altamente Adsorvido, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A-21209 | Diluição 1:250 |
| Burro anti-Rabbin IgG (H+L) Anticorpo Secundário Altamente Adsorvido, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-21206 | Diluição 1:250 |
| ZEISS Stemi 508 Stereo Microscópio | ZEISS | ||
| ZEISS Axio Vert.A1 Microscópio de rotina invertido com câmera digital | ZEISS | ||
| Primer Sequence | Forward (5'-3') | Reverse (5'-3') | _ |
| Lipocalin 2 (Lcn2) | GCAGGTGGTACGTTGTGGG | CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC | |
| Lactoferrina (Ltf) | TGAGGCCCTTGGACTCTGT | ACCCACTTTCTCATCTCGTTC | |
| Progesterona (Pgr) | CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC | TAACTTCAGACATCATTTCCGG | |
| Gliceraldeído 3 fosfato desidrogenase (Gapdh) | CAATGTGTCCGTCGTGGATCT | GCCTGCTTCACCACCTTCTT |
Referências
- Wang, H., Dey, S. K. Roadmap to embryo implantation: clues from mouse models. Nature Reviews Genetics. 7 (3), 185-199 (2006).
- Hibaoui, Y., Feki, A. Organoid models of human endometrial development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biol....
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Reimpressões e permissões
