غرفة مرنة لتصوير الخلايا الحية بفاصل زمني مع مجهر تشتت رامان المحفز
Summary
نبلغ عن غرفة بيئية مرنة على قمة المسرح لتصوير الفاصل الزمني للخلايا الحية باستخدام مجهر تشتت رامان المحفز المستقيم مع اكتشاف الإشارات المرسلة. تم تصوير قطرات الدهون في خلايا SKOV3 المعالجة بحمض الأوليك لمدة تصل إلى 24 ساعة مع فاصل زمني مدته 3 دقائق.
Abstract
الفحص المجهري لتشتت رامان المحفز (SRS) هو تقنية تصوير كيميائي خالية من الملصقات. تم عرض تصوير الخلايا الحية باستخدام SRS للعديد من التطبيقات البيولوجية والطبية الحيوية. ومع ذلك ، لم يتم اعتماد تصوير SRS طويل المدى للخلايا الحية على نطاق واسع. غالبا ما يستخدم الفحص المجهري SRS هدف الغمر في الماء بفتحة عددية عالية (NA) ومكثف غمر زيت NA عالي لتحقيق تصوير عالي الدقة. في هذه الحالة ، تكون الفجوة بين الهدف والمكثف بضعة ملليمترات فقط. لذلك ، لا يمكن استخدام معظم الغرف البيئية التجارية على سطح المسرح لتصوير SRS بسبب سمكها الكبير مع غطاء زجاجي صلب. تصف هذه الورقة تصميم وتصنيع غرفة مرنة يمكن استخدامها لتصوير الخلايا الحية بفاصل زمني مع اكتشاف إشارة SRS المرسلة على إطار مجهر مستقيم. يتم تحقيق مرونة الغرفة باستخدام مادة ناعمة – فيلم مطاطي طبيعي رقيق. يمكن إضافة العلبة الجديدة وتصميم الغرفة بسهولة إلى إعداد تصوير SRS الحالي. تظهر الاختبارات والنتائج الأولية أن نظام الغرفة المرنة يتيح تصوير SRS مستقرا وطويل الأجل بفاصل زمني للخلايا الحية ، والذي يمكن استخدامه في تطبيقات التصوير الحيوي المختلفة في المستقبل.
Introduction
يستخدم الفحص المجهري الضوئي لمراقبة الهياكل المجهرية للعينات. التصوير البصري سريع وأقل توغلا وأقل تدميرا من التقنيات الأخرى1. تم تطوير تصوير الخلايا الحية باستخدام المجهر الضوئي لالتقاط ديناميكيات الخلايا الحية المستزرعة على مدى فترةطويلة 2. توفر الأنواع المختلفة من التباينات الضوئية معلومات مميزة عن العينات البيولوجية. على سبيل المثال ، يظهر الفحص المجهري للطور البصري الاختلاف الدقيق في مؤشرات الانكسار عبر العينة3. يستخدم الفحص المجهري الفلوري على نطاق واسع لتصوير جزيئات حيوية أو عضيات خلوية محددة. ومع ذلك ، فإن أطياف الإثارة والانبعاث ذات النطاق العريض للتألق عادة ما تؤدي إلى تداخل طيفي عند إجراء تصوير متعدد الألوان4. جزيئات الفلورسنت حساسة للضوء ويمكن تبييضها بعد التعرض للضوء الدوري طويل الأمد. بالإضافة إلى ذلك ، قد يؤدي وضع العلامات الفلورية إلى تغيير التوزيع الحيوي للجزيئات في الخلايا5. الفحص المجهري SRS هو تقنية تصوير كيميائي خالية من الملصقات6. يعتمد تباين SRS على الانتقال الاهتزازي لروابط كيميائية محددة. غالبا ما يظهر التردد الاهتزازي لرابطة كيميائية عرض نطاق طيفي ضيق ، مما يجعل من الممكن تصوير نطاقات رامان متعددة في نفس العينات7. يعد الفحص المجهري SRS أداة فريدة لتصوير الخلايا الحية ، حيث يوفر تباينات كيميائية متعددة بطريقة خالية من الملصقات8.
بينما تم استخدام تصوير SRS للخلايا غير الملوثة في العديد من الدراسات ، لم يتم اعتماد تصوير SRS طويل المدى للخلايا الحية على نطاق واسع. أحد الأسباب هو أنه لا يمكن استخدام الغرف التجارية المفتوحة مباشرة لتصوير SRS بسبب سمكها الكبير9،10،11،12. تم تصميم هذه الغرف ذات الغطاء الزجاجي في الغالب للتصوير الساطع أو التصوير الفلوري باستخدام هدف NA مرتفع واحد مع مخطط الكشف الخلفي. ومع ذلك ، يفضل تصوير SRS الكشف المرسل باستخدام كل من هدف NA العالي ومكثف NA العالي ، والذي يترك فجوة قصيرة جدا (عادة بضعة ملليمترات) بين الهدف والمكثف. للتغلب على هذه المشكلة ، قمنا بتصميم غرفة مرنة باستخدام مادة ناعمة لتمكين تصوير SRS بفاصل زمني للخلايا الحية باستخدام إطار مجهر مستقيم. في هذا التصميم ، تم وضع هدف غمس الماء في الغرفة الناعمة ويمكن أن يتحرك بحرية في ثلاثة أبعاد لأغراض التركيز والتصوير.
درجة الحرارة المثلى لزراعة معظم خلايا الثدييات هي 37 درجة مئوية ، في حين أن درجة حرارة الغرفة دائما أقل بمقدار 10 درجات من ذلك. درجة الحرارة أعلى أو أقل من 37 درجة مئوية لها تأثير كبير على معدل نمو الخلايا13. لذلك ، يلزم التحكم في درجة حرارة بيئة زراعة الخلايا في نظام تصوير الخلايا الحية. من المعروف أن عدم استقرار درجة الحرارة سيؤدي إلى مشاكل في إلغاء التركيز أثناء التصوير طويل المدى14. لتحقيق بيئة مستقرة تبلغ 37 درجة مئوية ، قمنا ببناء غرفة حاوية كبيرة لتغطية إطار المجهر بالكامل ، بما في ذلك طبقة عازلة للحرارة أسفل المجهر (الشكل 1). داخل غرفة التحكم في درجة الحرارة الكبيرة ، تساعد الغرفة المرنة الصغيرة في الحفاظ بدقة على الرطوبة الفسيولوجية ودرجة الحموضة عبر تدفق الهواء المنظم المكمل ب 5٪ CO 2 (الشكل 2). تم قياس درجة حرارة ورطوبة الغرف للتأكد من أن تصميم الغرفة المزدوجة يوفر حالة زراعة الخلايا المثلى لنمو الخلايا تحت تصوير SRS الدوري طويل المدى (الشكل 3). ثم أظهرنا تطبيق النظام لتصوير الفاصل الزمني وتتبع قطرات الدهون (LDs) في الخلايا السرطانية SKOV3 (الشكل 4 والشكل 5 والشكل 6).
Protocol
Representative Results
Discussion
يعد الفحص المجهري SRS ذو الخلايا الحية ذات الفاصل الزمني تقنية تصوير بديلة لتتبع الجزيئات بطريقة خالية من الملصقات. بالمقارنة مع وضع العلامات الفلورية ، فإن تصوير SRS خال من التبييض الضوئي ، مما يتيح مراقبة الجزيئات على المدى الطويل. ومع ذلك ، حتى الآن ، فإن نظام التصوير بالخلايا الحية على مج…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر فريق التصميم الجامعي لعام 2019 (سوك تشول يون ، وإيان فوكستون ، ولويس مازا ، وجيمس والش) في جامعة بينغهامتون على تصميم وتصنيع واختبار صندوق حاوية المجهر. نشكر سكوت هانكوك وأولغا بتروفا وفابيولا مورينو أوليفاس في جامعة بينغهامتون على المناقشات المفيدة. تم دعم هذا البحث من قبل المعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة R15GM140444.
Materials
| A lab-built SRS microscope | https://rdcu.be/cP6ve | ||
| HF2LI 50 MHz lock-in amplifer | Zurich Instruments | HF2LI | |
| Iris diaphragm | Thorlabs Inc | SM1D12 | |
| Kinematic mirror mount | Thorlabs Inc | KM100 | |
| Microscope frame | Nikon Inc | FN-1 | |
| Motorized microscopy stage | Prior Scientific | Z-Deck | |
| Oil-immersion condenser (C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4) | Nikon Inc | MBL71405 | |
| Water-immersion objective (CFI75 Apo 25XC W 1300) | Nikon Inc | MRD77225 | |
| Materials and parts for the microscope enclosure (31'' x 29'' x 28'' L x W x H) | |||
| Airtherm heater module | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SAT-1W | |
| Airtherm heater controller, CO2 and humidity monitor | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SMT-1W | |
| Air/CO2 mixer module | World Precision Instruments (WPI) | ECU-HOC-W | |
| Flexible duct hose (2-1/2'' ID, 2-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 56675K71 | |
| High-temperature glass-mica ceramic, easy-to-machine (6'' x 6'', 1/4'' thickness) | McMaster-Carr | 8489K62 | |
| Polycarbonate sheets (thickness 0.25'') | McMaster-Carr | 8574K286 | |
| Silicone rubber sheets (36'' x 36'', thickness 1/8'') | McMaster-Carr | 5827T43 | |
| Materials and parts for the Flexible chamber | |||
| Hot plate | McMaster-Carr | 31745K11 | |
| High-purity inline filter, 1/4 NPT | McMaster-Carr | 6645T18 | |
| Hole saw (cutting diameter 1-7/8 inch) | McMaster-Carr | 4066A34 | |
| Hole saw (cutting diameter 50 mm) | McMaster-Carr | 4556A19 | |
| High-temperature silicone rubber tubing, soft, 2 mm ID, 5 mm OD | McMaster-Carr | 5054K313 | |
| Inline filter (1/4 NPT, 40 micron) | McMaster-Carr | 98385K843 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum round tube (1/8'' wall thickness, 4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K42 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum round tube (3/4'' wall thickness, 3-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K47 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum bar (12'' x 12'', thickness 1/4'') | McMaster-Carr | 8975K142 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum bar (8'' x 8'', thickness 3/8'') | McMaster-Carr | 9246K21 | |
| Objective nosepiece (single) | Nikon Inc | FN-MN-H | |
| Sample holder (modified) | Prior Scientific | HZ202 | |
| Ultra-thin natural rubber film (thickness 0.01'') | McMaster-Carr | 8611K13 | |
| Vacuum-sealable glass jar | McMaster-Carr | 3231T44 | |
| Software | |||
| MATLAB | MathWorks | ||
| ImageJ (Fiji) | imagej.net | ||
| ScanImage | Vidrio Technologies, LLC | SRS imaging software | |
| Materials for live-cell imaging | |||
| Cover glass bottom sterile culture dishes (Dia.x H, 50 x 7 mm) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70674-02 | |
| DMEM cell culture medium | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| LysoSensor fluorescent dye DND-189 | ThermoFisher Scientific | L7535 (Invitrogen) | |
| Oleic acid | MilliporeSigma | 364525 | |
| SKOV3 cell line | ATCC | HTB-77 |
Referências
- Mertz, J. . Introduction to Optical Microscopy. , (2019).
- Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
- Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G. Quantitative phase imaging in biomedicine. Nature Photonics. 12 (10), 578-589 (2018).
- Hu, C. D., Kerppola, T. K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).
- lamo, P., et al. Fluorescent dye labeling changes the biodistribution of tumor-targeted nanoparticles. Pharmaceutics. 12 (11), 1004 (2020).
- Cheng, J. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), aaa870 (2015).
- Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).
- Hill, A. H., Fu, D. Cellular imaging using stimulated Raman scattering microscopy. Analytical Chemistry. 91 (15), 9333-9342 (2019).
- Buđa, R., Vukušić, K., Tolić, I. . Methods in Cell Biology. (139), 81-101 (2017).
- Chiarelli, T. J., Grieshaber, N. A., Grieshaber, S. S. Live-cell forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants in Chlamydia trachomatis. Journal of Visualized Experiments. (160), e61365 (2020).
- Lemon, W. C., McDole, K. Live-cell imaging in the era of too many microscopes. Current Opinion in Cell Biology. 66, 34-42 (2020).
- Birk, S. E., et al. Management of oral biofilms by nisin delivery in adhesive microdevices. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 167, 83-88 (2021).
- Watanabe, I., Okada, S. Effects of temperature on growth rate of cultured mammalian cells (L5178Y). Journal of Cell Biology. 32 (2), 309-323 (1967).
- Lac, A., Lam, A. L., Heit, B. . Fluorescent Microscopy. , 57-73 (2022).
- Grossman, D. G. Machinable glass-ceramics based on tetrasilicic mica. Journal of the American Ceramic Society. 55 (9), 446-449 (1972).
- Yuan, Y., Shah, N., Almohaisin, M. I., Saha, S., Lu, F. Assessing fatty acid-induced lipotoxicity and its therapeutic potential in glioblastoma using stimulated Raman microscopy. Scientific Reports. 11 (1), 1-14 (2021).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomedical Engineering Online. 2 (1), 1-9 (2003).
- Sun, M. W., Yuan, Y. H., Lu, F. K., Di Pasqua, A. J. Physicochemical factors that influence the biocompatibility of cationic liposomes and their ability to deliver DNA to the nuclei of ovarian cancer SK-OV-3 cells. Materials. 14 (2), 416 (2021).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Ozeki, Y., Itoh, K. Stimulated Raman scattering microscopy for live-cell imaging with high contrast and high sensitivity. Laser Physics. 20 (5), 1114-1118 (2010).
- Zhang, X., et al. Label-free live-cell imaging of nucleic acids using stimulated Raman scattering microscopy. ChemPhysChem. 13 (4), 1054-1059 (2012).
- Stiebing, C., et al. Real-time Raman and SRS imaging of living human macrophages reveals cell-to-cell heterogeneity and dynamics of lipid uptake. Journal of Biophotonics. 10 (9), 1217-1226 (2017).
- Miao, K., Wei, L. Live-cell imaging and quantification of PolyQ aggregates by stimulated Raman scattering of selective deuterium labeling. ACS Central Science. 6 (4), 478-486 (2020).
- Brzozowski, K., et al. Stimulated Raman scattering microscopy in chemistry and life science -Development, innovation, perspectives. Biotechnology Advances. 60, 108003 (2022).
- Hislop, E. W., Tipping, W. J., Faulds, K., Graham, D. Label-free imaging of lipid droplets in prostate cells using stimulated Raman scattering microscopy and multivariate analysis. Analytical Chemistry. 94 (25), 8899-8908 (2022).
- Chen, T., Yavuz, A., Wang, M. C. Dissecting lipid droplet biology with coherent Raman scattering microscopy. Journal of Cell Science. 135 (5), jcs252353 (2022).
- Cao, C., Zhou, D., Chen, T., Streets, A. M., Huang, Y. Label-Free digital quantification of lipid droplets in single cells by stimulated Raman microscopy on a microfluidic platform. Analytical Chemistry. 88 (9), 4931-4939 (2016).
- Zhang, C., et al. Stimulated Raman scattering flow cytometry for label-free single-particle analysis. Optica. 4 (1), 103-109 (2017).
- Suzuki, Y., et al. Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (32), 15842-15848 (2019).
- Gala de Pablo, J., Lindley, M., Hiramatsu, K., Goda, K. High-throughput Raman flow cytometry and beyond. Accounts of Chemical Research. 54 (9), 2132-2143 (2021).
- Cole, R. Live-cell imaging: the cell’s perspective. Cell Adhesion & Migration. 8 (5), 452-459 (2014).
- Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging. Annals of the New York Academy of Sciences. 1048 (1), 321-330 (2005).
- Firestone, L., Cook, K., Culp, K., Talsania, N., Preston Jr, K. Comparison of autofocus methods for automated microscopy. Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 12 (3), 195-206 (1991).
- Van Helvert, S., Storm, C., Friedl, P. Mechanoreciprocity in cell migration. Nature Cell Biology. 20 (1), 8-20 (2018).
- Zong, C., et al. Plasmon-enhanced stimulated Raman scattering microscopy with single-molecule detection sensitivity. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
- Wei, L., et al. Super-multiplex vibrational imaging. Nature. 544 (7651), 465-470 (2017).
