אנו מדווחים על תא סביבתי גמיש ומתקדם להדמיה בהילוך מהיר של תאים חיים באמצעות מיקרוסקופ פיזור ראמאן מגורה זקוף עם זיהוי אותות משודרים. טיפות שומנים צולמו בתאי SKOV3 שטופלו בחומצה אולאית למשך עד 24 שעות במרווח זמן של 3 דקות.
מיקרוסקופ פיזור ראמאן מגורה (SRS) הוא טכנולוגיית הדמיה כימית ללא תוויות. דימות תאים חיים עם SRS הוכח עבור יישומים ביולוגיים וביו-רפואיים רבים. עם זאת, הדמיית SRS ארוכת טווח בהילוך מהיר של תאים חיים לא אומצה באופן נרחב. מיקרוסקופ SRS משתמש לעתים קרובות ביעד טבילה במים עם צמצם מספרי גבוה (NA) ובמעבה טבילת שמן NA גבוה כדי להשיג הדמיה ברזולוציה גבוהה. במקרה זה, הפער בין המטרה לבין המעבה הוא רק כמה מילימטרים. לכן, רוב התאים הסביבתיים המסחריים אינם יכולים לשמש להדמיית SRS בגלל עוביים הגדול עם כיסוי זכוכית קשיח. מאמר זה מתאר את התכנון והייצור של תא גמיש שניתן להשתמש בו להדמיית תאים חיים בהילוך מהיר עם זיהוי אותות SRS המשודרים במסגרת מיקרוסקופ זקוף. הגמישות של החדר מושגת באמצעות חומר רך – סרט גומי טבעי דק. ניתן להוסיף בקלות את המארז החדש ואת עיצוב התא למערך הדמיה SRS קיים. הבדיקות והתוצאות הראשוניות מראות כי מערכת התא הגמישה מאפשרת הדמיית SRS יציבה, ארוכת טווח ובהילוך מהיר של תאים חיים, אשר תוכל לשמש ליישומי הדמיה ביולוגית שונים בעתיד.
מיקרוסקופ אופטי משמש להתבוננות במיקרו-מבנים של דגימות. הדמיה אופטית היא מהירה, פחות פולשנית ופחות הרסנית מטכנולוגיות אחרות1. דימות תאים חיים עם מיקרוסקופ אופטי פותח כדי ללכוד את הדינמיקה של תאים חיים בתרבית במשך תקופה ארוכה2. סוגים שונים של ניגודים אופטיים מספקים מידע ברור על דגימות ביולוגיות. לדוגמה, מיקרוסקופ פאזה אופטי מראה את ההבדל הדק במדדי השבירה על פני מדגם3. מיקרוסקופ פלואורסצנטי נמצא בשימוש נרחב כדי לדמיין ביומולקולות ספציפיות או אברונים תאיים. עם זאת, ספקטרום העירור והפליטה בפס רחב של פלואורסצנטיות גורם בדרך כלל לחפיפה ספקטרלית כאשר מתבצעת הדמיה מרובת צבעים4. מולקולות פלואורסצנטיות רגישות לאור וניתן להלבין אותן לאחר חשיפה תקופתית ארוכת טווח לאור. בנוסף, תיוג פלואורסצנטי עשוי לשנות את הפיזור הביולוגי של המולקולות בתאים5. מיקרוסקופ SRS הוא טכנולוגיית הדמיה כימית ללא תוויות6. הניגודיות של SRS מסתמכת על מעבר רטט של קשרים כימיים ספציפיים. תדירות הרטט של קשר כימי מציגה לעתים קרובות רוחב פס ספקטרלי צר, מה שהופך את זה אפשרי לצלם רצועות ראמאן מרובות באותן דגימות7. מיקרוסקופ SRS הוא כלי ייחודי להדמיית תאים חיים, המספק ניגודים כימיים מרובים באופן נטול תוויות8.
בעוד שהדמיית SRS של תאים לא מוכתמים שימשה במחקרים רבים, הדמיית SRS ארוכת טווח בהילוך מהיר של תאים חיים לא אומצה באופן נרחב. אחת הסיבות לכך היא שלא ניתן להשתמש ישירות בתאים פתוחים מסחריים להדמיית SRS בגלל עוביים הגדול 9,10,11,12. תאים אלה עם מכסה זכוכית מתוכננים בעיקר עבור הדמיה של שדה בהיר או פלואורסצנטי באמצעות מטרת NA גבוהה אחת עם סכימת זיהוי לאחור. עם זאת, הדמיית SRS מעדיפה גילוי משודר הן באמצעות מטרת NA גבוהה והן באמצעות מעבה NA גבוה, אשר משאיר רק מרווח קצר מאוד (בדרך כלל כמה מילימטרים) בין המטרה לבין המעבה. כדי להתגבר על בעיה זו, תכננו תא גמיש באמצעות חומר רך כדי לאפשר הדמיית SRS בהילוך מהיר של תאים חיים באמצעות מסגרת מיקרוסקופ זקוף. בתכנון זה, מטרת טבילת המים הייתה סגורה בתא הרך ויכולה לנוע בחופשיות בתלת מימד למטרות מיקוד והדמיה.
הטמפרטורה האופטימלית לגידול רוב תאי היונקים היא 37 מעלות צלזיוס, בעוד שטמפרטורת החדר תמיד נמוכה ב -10 מעלות מכך. טמפרטורה גבוהה או נמוכה מ 37 °C יש השפעה דרמטית על קצב צמיחת התאים13. לכן, בקרת טמפרטורה של סביבת תרבית התא נדרשת במערכת דימות של תאים חיים. ידוע כי חוסר יציבות טמפרטורה יוביל לבעיות מיקוד במהלך הדמיה ארוכת טווח14. כדי להשיג סביבה יציבה של 37°C, בנינו תא מארז גדול שיכסה את כל מסגרת המיקרוסקופ, כולל שכבת בידוד תרמי מתחת למיקרוסקופ (איור 1). בתוך תא בקרת הטמפרטורה הגדול, התא הקטן והגמיש עוזר לשמור במדויק על הלחות הפיזיולוגית ועל רמת החומציות באמצעות זרימת האוויר המווסתת בתוספת 5% CO 2 (איור 2). הטמפרטורה והלחות של התאים נמדדו כדי לאשר שהתכנון הדו-תאי סיפק את תנאי תרבית התאים האופטימליים לצמיחת תאים בהדמיית SRS תקופתית ארוכת טווח (איור 3). לאחר מכן הדגמנו את היישום של המערכת עבור דימות בהילוך מהיר ומעקב אחר טיפות שומנים (LDs) בתאי סרטן SKOV3 (איור 4, איור 5 ואיור 6).
מיקרוסקופ SRS של תאים חיים בהילוך מהיר הוא טכניקת הדמיה חלופית למעקב אחר מולקולות באופן נטול תוויות. בהשוואה לתיוג פלואורסצנטי, הדמיית SRS אינה מלבינה פוטו, ומאפשרת ניטור ארוך טווח של מולקולות. עם זאת, נכון להיום, מערכת הדמיה של תאים חיים במיקרוסקופ SRS זקוף אינה זמינה מסחרית. בעבודה זו פותחה מ?…
The authors have nothing to disclose.
אנו רוצים להודות לצוות העיצוב הבכיר לתואר ראשון לשנת 2019 (סוק צ’ול יון, איאן פוקסטון, לואיס מאזה וג’יימס וולש) באוניברסיטת בינגהמטון על התכנון, הייצור והבדיקה של קופסת מארז המיקרוסקופ. אנו מודים לסקוט הנקוק, אולגה פטרובה ופביולה מורנו אוליבס מאוניברסיטת בינגהמטון על הדיונים המועילים. מחקר זה נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר R15GM140444.
A lab-built SRS microscope | https://rdcu.be/cP6ve | ||
HF2LI 50 MHz lock-in amplifer | Zurich Instruments | HF2LI | |
Iris diaphragm | Thorlabs Inc | SM1D12 | |
Kinematic mirror mount | Thorlabs Inc | KM100 | |
Microscope frame | Nikon Inc | FN-1 | |
Motorized microscopy stage | Prior Scientific | Z-Deck | |
Oil-immersion condenser (C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4) | Nikon Inc | MBL71405 | |
Water-immersion objective (CFI75 Apo 25XC W 1300) | Nikon Inc | MRD77225 | |
Materials and parts for the microscope enclosure (31'' x 29'' x 28'' L x W x H) | |||
Airtherm heater module | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SAT-1W | |
Airtherm heater controller, CO2 and humidity monitor | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SMT-1W | |
Air/CO2 mixer module | World Precision Instruments (WPI) | ECU-HOC-W | |
Flexible duct hose (2-1/2'' ID, 2-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 56675K71 | |
High-temperature glass-mica ceramic, easy-to-machine (6'' x 6'', 1/4'' thickness) | McMaster-Carr | 8489K62 | |
Polycarbonate sheets (thickness 0.25'') | McMaster-Carr | 8574K286 | |
Silicone rubber sheets (36'' x 36'', thickness 1/8'') | McMaster-Carr | 5827T43 | |
Materials and parts for the Flexible chamber | |||
Hot plate | McMaster-Carr | 31745K11 | |
High-purity inline filter, 1/4 NPT | McMaster-Carr | 6645T18 | |
Hole saw (cutting diameter 1-7/8 inch) | McMaster-Carr | 4066A34 | |
Hole saw (cutting diameter 50 mm) | McMaster-Carr | 4556A19 | |
High-temperature silicone rubber tubing, soft, 2 mm ID, 5 mm OD | McMaster-Carr | 5054K313 | |
Inline filter (1/4 NPT, 40 micron) | McMaster-Carr | 98385K843 | |
Multipurpose 6061 Aluminum round tube (1/8'' wall thickness, 4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K42 | |
Multipurpose 6061 Aluminum round tube (3/4'' wall thickness, 3-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K47 | |
Multipurpose 6061 Aluminum bar (12'' x 12'', thickness 1/4'') | McMaster-Carr | 8975K142 | |
Multipurpose 6061 Aluminum bar (8'' x 8'', thickness 3/8'') | McMaster-Carr | 9246K21 | |
Objective nosepiece (single) | Nikon Inc | FN-MN-H | |
Sample holder (modified) | Prior Scientific | HZ202 | |
Ultra-thin natural rubber film (thickness 0.01'') | McMaster-Carr | 8611K13 | |
Vacuum-sealable glass jar | McMaster-Carr | 3231T44 | |
Software | |||
MATLAB | MathWorks | ||
ImageJ (Fiji) | imagej.net | ||
ScanImage | Vidrio Technologies, LLC | SRS imaging software | |
Materials for live-cell imaging | |||
Cover glass bottom sterile culture dishes (Dia.x H, 50 x 7 mm) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70674-02 | |
DMEM cell culture medium | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
LysoSensor fluorescent dye DND-189 | ThermoFisher Scientific | L7535 (Invitrogen) | |
Oleic acid | MilliporeSigma | 364525 | |
SKOV3 cell line | ATCC | HTB-77 |