刺激ラマン散乱顕微鏡によるタイムラプス生細胞イメージングのための柔軟なチャンバー
Summary
我々は、送信シグナル検出を備えた直立刺激ラマン散乱顕微鏡を用いた生細胞のタイムラプスイメージングのためのステージトップの柔軟な環境チャンバーについて報告する。脂肪滴は、オレイン酸で処理したSKOV3細胞で最大24時間、3分の時間間隔で画像化されました。
Abstract
誘導ラマン散乱(SRS)顕微鏡は、ラベルフリーの化学イメージング技術です。SRSを用いた生細胞イメージングは、多くの生物学的および生物医学的用途で実証されています。しかし、生細胞の長期タイムラプスSRSイメージングは広く採用されていません。SRS顕微鏡では、高解像度のイメージングを実現するために、高開口数(NA)水浸対物レンズと高NA油浸コンデンサーを使用することがよくあります。この場合、対物レンズとコンデンサーの間のギャップはわずか数ミリメートルです。したがって、ほとんどの市販のステージトップ環境チャンバーは、剛性のあるガラスカバーで厚さが大きいため、SRSイメージングには使用できません。この論文では、正立顕微鏡フレーム上で送信されたSRS信号検出を備えたタイムラプスライブセルイメージングに使用できる柔軟なチャンバーの設計と製造について説明します。チャンバーの柔軟性は、柔らかい素材(薄い天然ゴムフィルム)を使用することで実現されます。新しいエンクロージャとチャンバーの設計は、既存のSRSイメージングセットアップに簡単に追加できます。試験と予備的な結果は、フレキシブルチャンバーシステムにより、生細胞の安定した長期タイムラプスSRSイメージングを可能にし、将来のさまざまなバイオイメージングアプリケーションに使用できることを示しています。
Introduction
光学顕微鏡は、サンプルの微細構造を観察するために使用されます。光学イメージングは、他の技術よりも迅速で、侵襲性が低く、破壊的ではありません1。光学顕微鏡による生細胞イメージングは、培養生細胞の動態を長期間にわたって捉えるために開発されています2。異なるタイプの光学コントラストは、生物学的サンプルに関する異なる情報を提供します。例えば、光学位相顕微鏡は、試料3全体の屈折率の微妙な違いを示す。蛍光顕微鏡は、特定の生体分子や細胞小器官の画像化に広く使用されています。しかしながら、蛍光の広帯域励起スペクトルおよび発光スペクトルは、通常、多色イメージングが行われるときにスペクトルオーバーラップをもたらす4。蛍光分子は光に敏感であり、長期間の定期的な光曝露後に漂白することができます。さらに、蛍光標識は、細胞5における分子の生体分布を変化させ得る。SRS顕微鏡は、ラベルフリーの化学イメージング技術です6。SRSのコントラストは、特定の化学結合の振動遷移に依存しています。化学結合の振動周波数は狭いスペクトル帯域幅を示すことが多く、同じサンプル内の複数のラマンバンドを画像化することが可能になります7。SRS顕微鏡は、生細胞イメージングのためのユニークなツールであり、ラベルフリーの方法で複数の化学的コントラストを提供します8。
染色されていない細胞のSRSイメージングは多くの研究に使用されていますが、生細胞の長期タイムラプスSRSイメージングは広く採用されていません。その理由の1つは、市販のオープンチャンバーは厚さ9,10,11,12が大きいため、SRSイメージングに直接使用できないことです。ガラス蓋付きのこれらのチャンバーは、主に、後方検出スキームを備えた単一の高NA対物レンズを使用した明視野または蛍光イメージング用に設計されています。ただし、SRSイメージングでは、高NA対物レンズと高NAコンデンサーの両方を使用した透過検出が好まれるため、対物レンズとコンデンサーの間に非常に短いギャップ(通常は数ミリメートル)しか残されません。この問題を克服するために、我々は、正立顕微鏡フレームを使用して生細胞のタイムラプスSRSイメージングを可能にするために、柔らかい材料を使用して柔軟なチャンバーを設計しました。この設計では、水浸対物レンズはソフトチャンバーに封入されており、焦点合わせとイメージングの目的で3次元で自由に移動できます。
ほとんどの哺乳類細胞を培養するのに最適な温度は37°Cですが、室温は常にこれより10°C低くなっています。37°Cより高いまたは低い温度は、細胞増殖速度に劇的な影響を及ぼします13。そのため、生細胞イメージングシステムにおいては細胞培養環境の温度制御が求められている。温度の不安定性は、長期イメージング中に焦点ぼけの問題につながることが知られています14。37°Cの安定した環境を実現するため、顕微鏡下の断熱層を含む顕微鏡フレーム全体を覆う大型の筐体チャンバーを構築しました(図1)。大きな温度制御チャンバー内では、小さな柔軟なチャンバーは、5%CO2を補充した調整された空気の流れを介して生理学的湿度とpHを正確に維持するのに役立ちます(図2)。チャンバーの温度と湿度を測定し、ダブルチャンバー設計が長期の定期的なSRSイメージング下での細胞増殖に最適な細胞培養条件を提供することを確認しました(図3)。次に、SKOV3がん細胞のタイムラプスイメージングと脂肪滴(LD)の追跡へのシステムの応用を実証しました(図4、図5、および図6)。
Protocol
Representative Results
Discussion
タイムラプス生細胞SRS顕微鏡は、ラベルフリーの方法で分子追跡を行うための代替イメージング技術です。蛍光標識と比較して、SRSイメージングは光退色がなく、分子の長期モニタリングが可能です。しかしながら、今日まで、正立SRS顕微鏡上の生細胞イメージングシステムは市販されていない。本研究では、安定した断熱顕微鏡エンクロージャボックスと柔軟な内部ソフトチャンバーを備?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ビンガムトン大学の2019年学部シニアデザインチーム(Suk Chul Yuon、Ian Foxton、Louis Mazza、James Walsh)に、顕微鏡エンクロージャーボックスの設計、製造、テストを行ったことに感謝します。有益な議論をしてくれたビンガムトン大学のスコット・ハンコック、オルガ・ペトロワ、ファビオラ・モレノ・オリバスに感謝します。この研究は、国立衛生研究所の支援を受けて、受賞番号R15GM140444で行われました。
Materials
| A lab-built SRS microscope | https://rdcu.be/cP6ve | ||
| HF2LI 50 MHz lock-in amplifer | Zurich Instruments | HF2LI | |
| Iris diaphragm | Thorlabs Inc | SM1D12 | |
| Kinematic mirror mount | Thorlabs Inc | KM100 | |
| Microscope frame | Nikon Inc | FN-1 | |
| Motorized microscopy stage | Prior Scientific | Z-Deck | |
| Oil-immersion condenser (C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4) | Nikon Inc | MBL71405 | |
| Water-immersion objective (CFI75 Apo 25XC W 1300) | Nikon Inc | MRD77225 | |
| Materials and parts for the microscope enclosure (31'' x 29'' x 28'' L x W x H) | |||
| Airtherm heater module | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SAT-1W | |
| Airtherm heater controller, CO2 and humidity monitor | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SMT-1W | |
| Air/CO2 mixer module | World Precision Instruments (WPI) | ECU-HOC-W | |
| Flexible duct hose (2-1/2'' ID, 2-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 56675K71 | |
| High-temperature glass-mica ceramic, easy-to-machine (6'' x 6'', 1/4'' thickness) | McMaster-Carr | 8489K62 | |
| Polycarbonate sheets (thickness 0.25'') | McMaster-Carr | 8574K286 | |
| Silicone rubber sheets (36'' x 36'', thickness 1/8'') | McMaster-Carr | 5827T43 | |
| Materials and parts for the Flexible chamber | |||
| Hot plate | McMaster-Carr | 31745K11 | |
| High-purity inline filter, 1/4 NPT | McMaster-Carr | 6645T18 | |
| Hole saw (cutting diameter 1-7/8 inch) | McMaster-Carr | 4066A34 | |
| Hole saw (cutting diameter 50 mm) | McMaster-Carr | 4556A19 | |
| High-temperature silicone rubber tubing, soft, 2 mm ID, 5 mm OD | McMaster-Carr | 5054K313 | |
| Inline filter (1/4 NPT, 40 micron) | McMaster-Carr | 98385K843 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum round tube (1/8'' wall thickness, 4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K42 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum round tube (3/4'' wall thickness, 3-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K47 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum bar (12'' x 12'', thickness 1/4'') | McMaster-Carr | 8975K142 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum bar (8'' x 8'', thickness 3/8'') | McMaster-Carr | 9246K21 | |
| Objective nosepiece (single) | Nikon Inc | FN-MN-H | |
| Sample holder (modified) | Prior Scientific | HZ202 | |
| Ultra-thin natural rubber film (thickness 0.01'') | McMaster-Carr | 8611K13 | |
| Vacuum-sealable glass jar | McMaster-Carr | 3231T44 | |
| Software | |||
| MATLAB | MathWorks | ||
| ImageJ (Fiji) | imagej.net | ||
| ScanImage | Vidrio Technologies, LLC | SRS imaging software | |
| Materials for live-cell imaging | |||
| Cover glass bottom sterile culture dishes (Dia.x H, 50 x 7 mm) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70674-02 | |
| DMEM cell culture medium | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| LysoSensor fluorescent dye DND-189 | ThermoFisher Scientific | L7535 (Invitrogen) | |
| Oleic acid | MilliporeSigma | 364525 | |
| SKOV3 cell line | ATCC | HTB-77 |
Referências
- Mertz, J. . Introduction to Optical Microscopy. , (2019).
- Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
- Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G. Quantitative phase imaging in biomedicine. Nature Photonics. 12 (10), 578-589 (2018).
- Hu, C. D., Kerppola, T. K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).
- lamo, P., et al. Fluorescent dye labeling changes the biodistribution of tumor-targeted nanoparticles. Pharmaceutics. 12 (11), 1004 (2020).
- Cheng, J. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), aaa870 (2015).
- Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).
- Hill, A. H., Fu, D. Cellular imaging using stimulated Raman scattering microscopy. Analytical Chemistry. 91 (15), 9333-9342 (2019).
- Buđa, R., Vukušić, K., Tolić, I. . Methods in Cell Biology. (139), 81-101 (2017).
- Chiarelli, T. J., Grieshaber, N. A., Grieshaber, S. S. Live-cell forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants in Chlamydia trachomatis. Journal of Visualized Experiments. (160), e61365 (2020).
- Lemon, W. C., McDole, K. Live-cell imaging in the era of too many microscopes. Current Opinion in Cell Biology. 66, 34-42 (2020).
- Birk, S. E., et al. Management of oral biofilms by nisin delivery in adhesive microdevices. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 167, 83-88 (2021).
- Watanabe, I., Okada, S. Effects of temperature on growth rate of cultured mammalian cells (L5178Y). Journal of Cell Biology. 32 (2), 309-323 (1967).
- Lac, A., Lam, A. L., Heit, B. . Fluorescent Microscopy. , 57-73 (2022).
- Grossman, D. G. Machinable glass-ceramics based on tetrasilicic mica. Journal of the American Ceramic Society. 55 (9), 446-449 (1972).
- Yuan, Y., Shah, N., Almohaisin, M. I., Saha, S., Lu, F. Assessing fatty acid-induced lipotoxicity and its therapeutic potential in glioblastoma using stimulated Raman microscopy. Scientific Reports. 11 (1), 1-14 (2021).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomedical Engineering Online. 2 (1), 1-9 (2003).
- Sun, M. W., Yuan, Y. H., Lu, F. K., Di Pasqua, A. J. Physicochemical factors that influence the biocompatibility of cationic liposomes and their ability to deliver DNA to the nuclei of ovarian cancer SK-OV-3 cells. Materials. 14 (2), 416 (2021).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Ozeki, Y., Itoh, K. Stimulated Raman scattering microscopy for live-cell imaging with high contrast and high sensitivity. Laser Physics. 20 (5), 1114-1118 (2010).
- Zhang, X., et al. Label-free live-cell imaging of nucleic acids using stimulated Raman scattering microscopy. ChemPhysChem. 13 (4), 1054-1059 (2012).
- Stiebing, C., et al. Real-time Raman and SRS imaging of living human macrophages reveals cell-to-cell heterogeneity and dynamics of lipid uptake. Journal of Biophotonics. 10 (9), 1217-1226 (2017).
- Miao, K., Wei, L. Live-cell imaging and quantification of PolyQ aggregates by stimulated Raman scattering of selective deuterium labeling. ACS Central Science. 6 (4), 478-486 (2020).
- Brzozowski, K., et al. Stimulated Raman scattering microscopy in chemistry and life science -Development, innovation, perspectives. Biotechnology Advances. 60, 108003 (2022).
- Hislop, E. W., Tipping, W. J., Faulds, K., Graham, D. Label-free imaging of lipid droplets in prostate cells using stimulated Raman scattering microscopy and multivariate analysis. Analytical Chemistry. 94 (25), 8899-8908 (2022).
- Chen, T., Yavuz, A., Wang, M. C. Dissecting lipid droplet biology with coherent Raman scattering microscopy. Journal of Cell Science. 135 (5), jcs252353 (2022).
- Cao, C., Zhou, D., Chen, T., Streets, A. M., Huang, Y. Label-Free digital quantification of lipid droplets in single cells by stimulated Raman microscopy on a microfluidic platform. Analytical Chemistry. 88 (9), 4931-4939 (2016).
- Zhang, C., et al. Stimulated Raman scattering flow cytometry for label-free single-particle analysis. Optica. 4 (1), 103-109 (2017).
- Suzuki, Y., et al. Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (32), 15842-15848 (2019).
- Gala de Pablo, J., Lindley, M., Hiramatsu, K., Goda, K. High-throughput Raman flow cytometry and beyond. Accounts of Chemical Research. 54 (9), 2132-2143 (2021).
- Cole, R. Live-cell imaging: the cell’s perspective. Cell Adhesion & Migration. 8 (5), 452-459 (2014).
- Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging. Annals of the New York Academy of Sciences. 1048 (1), 321-330 (2005).
- Firestone, L., Cook, K., Culp, K., Talsania, N., Preston Jr, K. Comparison of autofocus methods for automated microscopy. Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 12 (3), 195-206 (1991).
- Van Helvert, S., Storm, C., Friedl, P. Mechanoreciprocity in cell migration. Nature Cell Biology. 20 (1), 8-20 (2018).
- Zong, C., et al. Plasmon-enhanced stimulated Raman scattering microscopy with single-molecule detection sensitivity. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
- Wei, L., et al. Super-multiplex vibrational imaging. Nature. 544 (7651), 465-470 (2017).
