Uma câmara flexível para imagens de células vivas com lapso de tempo com microscopia de espalhamento Raman estimulada
Summary
Relatamos uma câmara ambiental flexível e de estágio para obtenção de imagens de lapso de tempo de células vivas usando microscopia de espalhamento Raman estimulada vertical com detecção de sinal transmitido. As gotículas lipídicas foram fotografadas em células SKOV3 tratadas com ácido oleico por até 24 h com um intervalo de tempo de 3 min.
Abstract
A microscopia de espalhamento Raman estimulado (SRS) é uma tecnologia de imagem química livre de marcação. A imagem de células vivas com SRS tem sido demonstrada para muitas aplicações biológicas e biomédicas. No entanto, a imagem de longo prazo com SRS de lapso de tempo de células vivas não tem sido amplamente adotada. A microscopia SRS geralmente usa uma objetiva de imersão em água de alta abertura numérica (NA) e um condensador de imersão em óleo de alto NA para obter imagens de alta resolução. Neste caso, o espaço entre a objetiva e o condensador é de apenas alguns milímetros. Portanto, a maioria das câmaras ambientais comerciais de topo de palco não pode ser usada para imagens SRS devido à sua grande espessura com uma cobertura de vidro rígida. Este artigo descreve o projeto e a fabricação de uma câmara flexível que pode ser usada para imagens de células vivas com lapso de tempo com detecção de sinal SRS transmitido em um quadro de microscópio vertical. A flexibilidade da câmara é alcançada usando um material macio – uma fina película de borracha natural. O novo design do gabinete e da câmara pode ser facilmente adicionado a uma configuração de imagem SRS existente. Os testes e os resultados preliminares demonstram que o sistema de câmara flexível permite imagens SRS estáveis, de longo prazo e com lapso de tempo de células vivas, que podem ser usadas para várias aplicações de bioimagem no futuro.
Introduction
A microscopia óptica é utilizada para observar as microestruturas das amostras. A imagem óptica é rápida, menos invasiva e menos destrutiva do que outras tecnologias1. A imagem de células vivas com microscopia óptica é desenvolvida para capturar a dinâmica de células vivas cultivadas por um longo período2. Diferentes tipos de contrastes ópticos fornecem informações distintas sobre amostras biológicas. Por exemplo, a microscopia óptica de fase mostra a diferença sutil nos índices de refração ao longo da amostra3. A microscopia de fluorescência é amplamente utilizada para obter imagens de biomoléculas específicas ou organelas celulares. No entanto, os espectros de excitação e emissão de fluorescência geralmente resultam em sobreposição espectral quando imagens multicoloridas são realizadas4. As moléculas fluorescentes são sensíveis à luz e podem ser branqueadas após exposição periódica à luz a longo prazo. Além disso, a marcação por fluorescência pode alterar a biodistribuição das moléculas nas células5. A microscopia SRS é uma tecnologia de imagem química livre demarcação6. O contraste do SRS depende da transição vibracional de ligações químicas específicas. A frequência vibracional de uma ligação química frequentemente exibe uma largura de banda espectral estreita, tornando viável a obtenção de imagens de múltiplas bandas Raman nas mesmas amostras7. A microscopia SRS é uma ferramenta única para imagens de células vivas, fornecendo múltiplos contrastes químicos de forma livre demarcação8.
Embora a imagem SRS de células não coradas tenha sido usada para muitos estudos, a imagem SRS de longo prazo com lapso de tempo de células vivas não foi amplamente adotada. Uma razão é que as câmaras abertas comerciais não podem ser usadas diretamente para imagens SRS devido à sua grande espessura 9,10,11,12. Essas câmaras com tampa de vidro são projetadas principalmente para imagens de campo brilhante ou fluorescência usando uma única objetiva de NA alta com um esquema de detecção para trás. No entanto, a imagem SRS prefere a detecção transmitida usando uma objetiva de NA alta e um condensador de NA alto, o que deixa apenas um intervalo muito curto (normalmente alguns milímetros) entre a objetiva e o condensador. Para superar esse problema, projetamos uma câmara flexível usando um material macio para permitir imagens SRS de lapso de tempo de células vivas usando uma estrutura de microscópio vertical. Neste projeto, a objetiva de imersão de água foi fechada na câmara mole e pode mover-se livremente em três dimensões para fins de focalização e imagem.
A temperatura ideal para o cultivo da maioria das células de mamíferos é de 37 °C, enquanto a temperatura ambiente é sempre 10 ° inferior a esta. Temperaturas superiores ou inferiores a 37 °C têm um efeito dramático na taxa de crescimento celular13. Portanto, o controle da temperatura do ambiente de cultura celular é necessário em um sistema de imagem de células vivas. Sabe-se que a instabilidade da temperatura levará a problemas de desfocalização durante exames de imagem de longo prazo14. Para alcançar um ambiente estável de 37 °C, construímos uma grande câmara de fechamento para cobrir toda a estrutura do microscópio, incluindo uma camada de isolamento térmico sob o microscópio (Figura 1). Dentro da considerável câmara de controle de temperatura, a pequena câmara flexível ajuda a manter com precisão a umidade fisiológica e o pH através do fluxo de ar regulado suplementado com 5% de CO 2 (Figura 2). A temperatura e a umidade das câmaras foram medidas para confirmar que o desenho de câmara dupla forneceu a condição ideal de cultura celular para o crescimento celular sob imagens SRS periódicas de longo prazo (Figura 3). Em seguida, demonstramos a aplicação do sistema para obtenção de imagens por lapso de tempo e rastreamento de gotículas lipídicas (DLs) em células cancerosas SKOV3 (Figura 4, Figura 5 e Figura 6).
Protocol
Representative Results
Discussion
A microscopia SRS de células vivas com lapso de tempo é uma técnica alternativa de imagem para rastreamento de moléculas de maneira livre de marcação. Em comparação com a marcação por fluorescência, a imagem SRS é livre de fotoclareamento, permitindo o monitoramento de moléculas a longo prazo. No entanto, até o momento, o sistema de imagem de células vivas em uma microscopia SRS vertical não está disponível comercialmente. Neste trabalho, um sistema de imagem de células vivas com uma caixa de gabinete …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Queremos agradecer à Equipe de Design Sênior de Graduação de 2019 (Suk Chul Yoon, Ian Foxton, Louis Mazza e James Walsh) da Universidade de Binghamton pelo projeto, fabricação e teste da caixa de gabinete do microscópio. Agradecemos a Scott Hancock, Olga Petrova e Fabiola Moreno Olivas da Universidade de Binghamton pelas discussões úteis. Esta pesquisa foi apoiada pelo National Institutes of Health sob o número de prêmio R15GM140444.
Materials
| A lab-built SRS microscope | https://rdcu.be/cP6ve | ||
| HF2LI 50 MHz lock-in amplifer | Zurich Instruments | HF2LI | |
| Iris diaphragm | Thorlabs Inc | SM1D12 | |
| Kinematic mirror mount | Thorlabs Inc | KM100 | |
| Microscope frame | Nikon Inc | FN-1 | |
| Motorized microscopy stage | Prior Scientific | Z-Deck | |
| Oil-immersion condenser (C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4) | Nikon Inc | MBL71405 | |
| Water-immersion objective (CFI75 Apo 25XC W 1300) | Nikon Inc | MRD77225 | |
| Materials and parts for the microscope enclosure (31'' x 29'' x 28'' L x W x H) | |||
| Airtherm heater module | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SAT-1W | |
| Airtherm heater controller, CO2 and humidity monitor | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SMT-1W | |
| Air/CO2 mixer module | World Precision Instruments (WPI) | ECU-HOC-W | |
| Flexible duct hose (2-1/2'' ID, 2-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 56675K71 | |
| High-temperature glass-mica ceramic, easy-to-machine (6'' x 6'', 1/4'' thickness) | McMaster-Carr | 8489K62 | |
| Polycarbonate sheets (thickness 0.25'') | McMaster-Carr | 8574K286 | |
| Silicone rubber sheets (36'' x 36'', thickness 1/8'') | McMaster-Carr | 5827T43 | |
| Materials and parts for the Flexible chamber | |||
| Hot plate | McMaster-Carr | 31745K11 | |
| High-purity inline filter, 1/4 NPT | McMaster-Carr | 6645T18 | |
| Hole saw (cutting diameter 1-7/8 inch) | McMaster-Carr | 4066A34 | |
| Hole saw (cutting diameter 50 mm) | McMaster-Carr | 4556A19 | |
| High-temperature silicone rubber tubing, soft, 2 mm ID, 5 mm OD | McMaster-Carr | 5054K313 | |
| Inline filter (1/4 NPT, 40 micron) | McMaster-Carr | 98385K843 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum round tube (1/8'' wall thickness, 4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K42 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum round tube (3/4'' wall thickness, 3-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K47 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum bar (12'' x 12'', thickness 1/4'') | McMaster-Carr | 8975K142 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum bar (8'' x 8'', thickness 3/8'') | McMaster-Carr | 9246K21 | |
| Objective nosepiece (single) | Nikon Inc | FN-MN-H | |
| Sample holder (modified) | Prior Scientific | HZ202 | |
| Ultra-thin natural rubber film (thickness 0.01'') | McMaster-Carr | 8611K13 | |
| Vacuum-sealable glass jar | McMaster-Carr | 3231T44 | |
| Software | |||
| MATLAB | MathWorks | ||
| ImageJ (Fiji) | imagej.net | ||
| ScanImage | Vidrio Technologies, LLC | SRS imaging software | |
| Materials for live-cell imaging | |||
| Cover glass bottom sterile culture dishes (Dia.x H, 50 x 7 mm) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70674-02 | |
| DMEM cell culture medium | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| LysoSensor fluorescent dye DND-189 | ThermoFisher Scientific | L7535 (Invitrogen) | |
| Oleic acid | MilliporeSigma | 364525 | |
| SKOV3 cell line | ATCC | HTB-77 |
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