Гибкая камера для покадровой визуализации живых клеток с помощью микроскопии со стимулированным комбинационным рассеянием света
Summary
Мы сообщаем о том, что в верхней части сцены используется гибкая экологическая камера для покадровой визуализации живых клеток с использованием вертикальной вынужденной микроскопии комбинационного рассеяния света с детектированием передаваемого сигнала. Липидные капли визуализировали в клетках SKOV3, обработанных олеиновой кислотой, в течение 24 ч с интервалом времени 3 мин.
Abstract
Микроскопия с вынужденным комбинационным рассеянием света (SRS) представляет собой технологию химической визуализации без меток. Визуализация живых клеток с помощью SRS была продемонстрирована для многих биологических и биомедицинских применений. Тем не менее, долгосрочная покадровая SRS-визуализация живых клеток не получила широкого распространения. В микроскопии SRS часто используется объектив с высокой числовой апертурой (NA) и масляный конденсатор с высоким содержанием NA для получения изображений с высоким разрешением. В этом случае зазор между объективом и конденсатором составляет всего несколько миллиметров. Поэтому большинство коммерческих сценических экологических камер не могут быть использованы для визуализации SRS из-за их большой толщины с жесткой стеклянной крышкой. В этой статье описывается конструкция и изготовление гибкой камеры, которая может быть использована для покадровой визуализации живых клеток с детектированием передаваемого сигнала SRS на вертикальной рамке микроскопа. Гибкость камеры достигается за счет использования мягкого материала – тонкой пленки натурального каучука. Новая конструкция корпуса и камеры может быть легко добавлена к существующей установке визуализации SRS. Испытания и предварительные результаты показывают, что гибкая камерная система обеспечивает стабильную, долгосрочную, покадровую SRS-визуализацию живых клеток, которая может быть использована для различных приложений биовизуализации в будущем.
Introduction
Оптическая микроскопия используется для наблюдения за микроструктурами образцов. Оптическая визуализация является быстрой, менее инвазивной и менее разрушительной, чем другие технологии1. Визуализация живых клеток с помощью оптической микроскопии разработана для захвата динамики культивируемых живых клеток в течение длительного периода2. Различные типы оптических контрастов предоставляют различную информацию о биологических образцах. Например, оптическая фазовая микроскопия показывает тонкую разницу в показателях преломления в образце3. Флуоресцентная микроскопия широко используется для визуализации конкретных биомолекул или клеточных органелл. Однако широкополосные спектры возбуждения и излучения флуоресценции обычно приводят к спектральному перекрытию при выполнении многоцветной визуализации4. Флуоресцентные молекулы светочувствительны и могут быть обесцвечены после длительного периодического воздействия света. Кроме того, флуоресцентная маркировка может изменить биораспределение молекул в клетках5. Микроскопия SRS – это технология химической визуализации без меток6. Контраст SRS основан на колебательном переходе определенных химических связей. Колебательная частота химической связи часто имеет узкую спектральную полосу пропускания, что позволяет получать изображения нескольких полос комбинационного рассеяния света в одних и тех же образцах7. Микроскопия SRS — это уникальный инструмент для визуализации живых клеток, обеспечивающий множественные химические контрасты без меток8.
В то время как SRS-визуализация неокрашенных клеток использовалась для многих исследований, долгосрочная покадровая SRS-визуализация живых клеток не получила широкого распространения. Одна из причин заключается в том, что коммерческие открытые камеры не могут быть непосредственно использованы для визуализации SRS из-за их большой толщины 9,10,11,12. Эти камеры со стеклянной крышкой в основном предназначены для визуализации светлого поля или флуоресценции с использованием одного объектива с высоким уровнем NA со схемой обратного обнаружения. Тем не менее, SRS-визуализация предпочитает передаваемое обнаружение с использованием как объектива с высоким NA, так и конденсатора с высоким NA, что оставляет только очень короткий зазор (обычно несколько миллиметров) между объективом и конденсатором. Чтобы преодолеть эту проблему, мы разработали гибкую камеру с использованием мягкого материала, чтобы обеспечить покадровую SRS-визуализацию живых клеток с использованием вертикальной рамки микроскопа. В этой конструкции объектив для погружения в воду был заключен в мягкую камеру и может свободно перемещаться в трех измерениях для фокусировки и визуализации.
Оптимальная температура для культивирования большинства клеток млекопитающих составляет 37 ° C, в то время как температура в помещении всегда на 10 ° ниже. Температура выше или ниже 37 °C оказывает существенное влияние на скорость роста клеток13. Поэтому в системе визуализации живых клеток требуется контроль температуры среды клеточных культур. Известно, что температурная нестабильность приведет к проблемам с расфокусировкой при длительной визуализации14. Для достижения стабильной температуры 37 °C мы построили большую камеру корпуса, которая покрывает всю раму микроскопа, включая теплоизоляционный слой под микроскопом (рис. 1). В большой камере контроля температуры небольшая гибкая камера помогает точно поддерживать физиологическую влажность и рН за счет регулируемого воздушного потока, дополненного 5% CO 2 (рис. 2). Температура и влажность камер были измерены, чтобы подтвердить, что двухкамерная конструкция обеспечивает оптимальные условия культивирования клеток для роста клеток при длительной периодической визуализации SRS (рис. 3). Затем мы продемонстрировали применение системы для покадровой визуализации и отслеживания липидных капель (LD) в раковых клетках SKOV3 (рис. 4, рис. 5 и рис. 6).
Protocol
Representative Results
Discussion
Покадровая SRS-микроскопия живых клеток является альтернативным методом визуализации для отслеживания молекул без меток. По сравнению с флуоресцентной маркировкой, визуализация SRS не подвержена фотообесцвечиванию, что позволяет осуществлять долгосрочный мониторинг молекул. Однако н?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотим поблагодарить группу старших дизайнеров бакалавриата 2019 года (Сук Чул Юн, Ян Фокстон, Луи Мацца и Джеймс Уолш) в Бингемтонском университете за проектирование, изготовление и тестирование корпуса микроскопа. Мы благодарим Скотта Хэнкока, Ольгу Петрову и Фабиолу Морено Оливас из Бингемтонского университета за полезные дискуссии. Это исследование было поддержано Национальными институтами здравоохранения под номером R15GM140444.
Materials
| A lab-built SRS microscope | https://rdcu.be/cP6ve | ||
| HF2LI 50 MHz lock-in amplifer | Zurich Instruments | HF2LI | |
| Iris diaphragm | Thorlabs Inc | SM1D12 | |
| Kinematic mirror mount | Thorlabs Inc | KM100 | |
| Microscope frame | Nikon Inc | FN-1 | |
| Motorized microscopy stage | Prior Scientific | Z-Deck | |
| Oil-immersion condenser (C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4) | Nikon Inc | MBL71405 | |
| Water-immersion objective (CFI75 Apo 25XC W 1300) | Nikon Inc | MRD77225 | |
| Materials and parts for the microscope enclosure (31'' x 29'' x 28'' L x W x H) | |||
| Airtherm heater module | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SAT-1W | |
| Airtherm heater controller, CO2 and humidity monitor | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SMT-1W | |
| Air/CO2 mixer module | World Precision Instruments (WPI) | ECU-HOC-W | |
| Flexible duct hose (2-1/2'' ID, 2-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 56675K71 | |
| High-temperature glass-mica ceramic, easy-to-machine (6'' x 6'', 1/4'' thickness) | McMaster-Carr | 8489K62 | |
| Polycarbonate sheets (thickness 0.25'') | McMaster-Carr | 8574K286 | |
| Silicone rubber sheets (36'' x 36'', thickness 1/8'') | McMaster-Carr | 5827T43 | |
| Materials and parts for the Flexible chamber | |||
| Hot plate | McMaster-Carr | 31745K11 | |
| High-purity inline filter, 1/4 NPT | McMaster-Carr | 6645T18 | |
| Hole saw (cutting diameter 1-7/8 inch) | McMaster-Carr | 4066A34 | |
| Hole saw (cutting diameter 50 mm) | McMaster-Carr | 4556A19 | |
| High-temperature silicone rubber tubing, soft, 2 mm ID, 5 mm OD | McMaster-Carr | 5054K313 | |
| Inline filter (1/4 NPT, 40 micron) | McMaster-Carr | 98385K843 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum round tube (1/8'' wall thickness, 4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K42 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum round tube (3/4'' wall thickness, 3-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K47 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum bar (12'' x 12'', thickness 1/4'') | McMaster-Carr | 8975K142 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum bar (8'' x 8'', thickness 3/8'') | McMaster-Carr | 9246K21 | |
| Objective nosepiece (single) | Nikon Inc | FN-MN-H | |
| Sample holder (modified) | Prior Scientific | HZ202 | |
| Ultra-thin natural rubber film (thickness 0.01'') | McMaster-Carr | 8611K13 | |
| Vacuum-sealable glass jar | McMaster-Carr | 3231T44 | |
| Software | |||
| MATLAB | MathWorks | ||
| ImageJ (Fiji) | imagej.net | ||
| ScanImage | Vidrio Technologies, LLC | SRS imaging software | |
| Materials for live-cell imaging | |||
| Cover glass bottom sterile culture dishes (Dia.x H, 50 x 7 mm) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70674-02 | |
| DMEM cell culture medium | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| LysoSensor fluorescent dye DND-189 | ThermoFisher Scientific | L7535 (Invitrogen) | |
| Oleic acid | MilliporeSigma | 364525 | |
| SKOV3 cell line | ATCC | HTB-77 |
Referências
- Mertz, J. . Introduction to Optical Microscopy. , (2019).
- Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
- Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G. Quantitative phase imaging in biomedicine. Nature Photonics. 12 (10), 578-589 (2018).
- Hu, C. D., Kerppola, T. K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).
- lamo, P., et al. Fluorescent dye labeling changes the biodistribution of tumor-targeted nanoparticles. Pharmaceutics. 12 (11), 1004 (2020).
- Cheng, J. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), aaa870 (2015).
- Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).
- Hill, A. H., Fu, D. Cellular imaging using stimulated Raman scattering microscopy. Analytical Chemistry. 91 (15), 9333-9342 (2019).
- Buđa, R., Vukušić, K., Tolić, I. . Methods in Cell Biology. (139), 81-101 (2017).
- Chiarelli, T. J., Grieshaber, N. A., Grieshaber, S. S. Live-cell forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants in Chlamydia trachomatis. Journal of Visualized Experiments. (160), e61365 (2020).
- Lemon, W. C., McDole, K. Live-cell imaging in the era of too many microscopes. Current Opinion in Cell Biology. 66, 34-42 (2020).
- Birk, S. E., et al. Management of oral biofilms by nisin delivery in adhesive microdevices. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 167, 83-88 (2021).
- Watanabe, I., Okada, S. Effects of temperature on growth rate of cultured mammalian cells (L5178Y). Journal of Cell Biology. 32 (2), 309-323 (1967).
- Lac, A., Lam, A. L., Heit, B. . Fluorescent Microscopy. , 57-73 (2022).
- Grossman, D. G. Machinable glass-ceramics based on tetrasilicic mica. Journal of the American Ceramic Society. 55 (9), 446-449 (1972).
- Yuan, Y., Shah, N., Almohaisin, M. I., Saha, S., Lu, F. Assessing fatty acid-induced lipotoxicity and its therapeutic potential in glioblastoma using stimulated Raman microscopy. Scientific Reports. 11 (1), 1-14 (2021).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomedical Engineering Online. 2 (1), 1-9 (2003).
- Sun, M. W., Yuan, Y. H., Lu, F. K., Di Pasqua, A. J. Physicochemical factors that influence the biocompatibility of cationic liposomes and their ability to deliver DNA to the nuclei of ovarian cancer SK-OV-3 cells. Materials. 14 (2), 416 (2021).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Ozeki, Y., Itoh, K. Stimulated Raman scattering microscopy for live-cell imaging with high contrast and high sensitivity. Laser Physics. 20 (5), 1114-1118 (2010).
- Zhang, X., et al. Label-free live-cell imaging of nucleic acids using stimulated Raman scattering microscopy. ChemPhysChem. 13 (4), 1054-1059 (2012).
- Stiebing, C., et al. Real-time Raman and SRS imaging of living human macrophages reveals cell-to-cell heterogeneity and dynamics of lipid uptake. Journal of Biophotonics. 10 (9), 1217-1226 (2017).
- Miao, K., Wei, L. Live-cell imaging and quantification of PolyQ aggregates by stimulated Raman scattering of selective deuterium labeling. ACS Central Science. 6 (4), 478-486 (2020).
- Brzozowski, K., et al. Stimulated Raman scattering microscopy in chemistry and life science -Development, innovation, perspectives. Biotechnology Advances. 60, 108003 (2022).
- Hislop, E. W., Tipping, W. J., Faulds, K., Graham, D. Label-free imaging of lipid droplets in prostate cells using stimulated Raman scattering microscopy and multivariate analysis. Analytical Chemistry. 94 (25), 8899-8908 (2022).
- Chen, T., Yavuz, A., Wang, M. C. Dissecting lipid droplet biology with coherent Raman scattering microscopy. Journal of Cell Science. 135 (5), jcs252353 (2022).
- Cao, C., Zhou, D., Chen, T., Streets, A. M., Huang, Y. Label-Free digital quantification of lipid droplets in single cells by stimulated Raman microscopy on a microfluidic platform. Analytical Chemistry. 88 (9), 4931-4939 (2016).
- Zhang, C., et al. Stimulated Raman scattering flow cytometry for label-free single-particle analysis. Optica. 4 (1), 103-109 (2017).
- Suzuki, Y., et al. Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (32), 15842-15848 (2019).
- Gala de Pablo, J., Lindley, M., Hiramatsu, K., Goda, K. High-throughput Raman flow cytometry and beyond. Accounts of Chemical Research. 54 (9), 2132-2143 (2021).
- Cole, R. Live-cell imaging: the cell’s perspective. Cell Adhesion & Migration. 8 (5), 452-459 (2014).
- Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging. Annals of the New York Academy of Sciences. 1048 (1), 321-330 (2005).
- Firestone, L., Cook, K., Culp, K., Talsania, N., Preston Jr, K. Comparison of autofocus methods for automated microscopy. Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 12 (3), 195-206 (1991).
- Van Helvert, S., Storm, C., Friedl, P. Mechanoreciprocity in cell migration. Nature Cell Biology. 20 (1), 8-20 (2018).
- Zong, C., et al. Plasmon-enhanced stimulated Raman scattering microscopy with single-molecule detection sensitivity. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
- Wei, L., et al. Super-multiplex vibrational imaging. Nature. 544 (7651), 465-470 (2017).
