Här presenterar vi ett protokoll för att kvantifiera den fysiologiska betydelsen av effekten av brun fettvävnadsaktivitet (BAT) på mänsklig metabolism. Detta uppnås genom att kombinera kolhydratbelastning och indirekt kalorimetri med mätningar av supraklavikulära temperaturförändringar. Detta nya tillvägagångssätt kan bidra till att utveckla ett farmakologiskt mål för BAT-termogenes hos människa.
Hos däggdjur aktiveras brun fettvävnad (BAT) snabbt som svar på kyla för att bibehålla kroppstemperaturen. Även om BAT har studerats mycket på små djur är det svårt att mäta BAT-aktiviteten hos människor. Därför är lite känt om BAT:s värmealstrande kapacitet och fysiologiska betydelse hos människor, inklusive i vilken grad kostkomponenter kan aktivera bästa tillgängliga teknik. Detta beror på begränsningarna i den för närvarande mest använda metoden för att bedöma aktiveringen av BAT-radioaktivt märkt glukos (fluorodeoxiglukos eller 18FDG) mätt med positronemissionstomografi-datortomografi (PET-CT).
Denna metod utförs vanligtvis på fastande personer, eftersom utfodring inducerar glukosupptag av musklerna, vilket kan maskera glukosupptaget i BAT. Detta dokument beskriver ett detaljerat protokoll för kvantifiering av människans totala energiförbrukning och substratutnyttjande från BAT-termogenes genom att kombinera indirekt kalorimetri, infraröd termografi och blodsockerövervakning hos kolhydratladdade vuxna män. För att karakterisera den fysiologiska betydelsen av bästa tillgängliga teknik är mått på BAT-aktivitetens inverkan på människors hälsa avgörande. Vi demonstrerar ett protokoll för att uppnå detta genom att kombinera kolhydratbelastning och indirekt kalorimetri med mätningar av supraklavikulära temperaturförändringar. Detta nya tillvägagångssätt kommer att bidra till att förstå fysiologin och farmakologin för BAT-termogenes hos människor.
Brun fettvävnad (BAT) skiljer sig framför allt från vit fettvävnad (WAT) i sitt mitokondriella innehåll, sympatisk innervation, multilokulära lipiddroppar, värmegenererande förmåga och anatomisk fördelning. BAT ansågs endast förekomma hos spädbarn och små däggdjur fram till bekräftelsen av dess förekomst hos vuxna människor 2009 1,2,3. Fram till relativt nyligen har BAT:s roll i humanfysiologi och metabolisk homeostas därför varit dåligt förstådd. Omfattande studier på små djur har visat att mer än hälften av metabolismen under kall exponering beror på BAT4:s icke-frossande termogena förmåga. Flera studier har visat att vid mild exponering för kyla (17–18 °C) korrelerar ökningar av energiförbrukning och glukosupptag i BAT starkt med BAT-termogenesen hos människa 5,6,7. Dessutom kan BAT-termogenes bidra med upp till 10 % av energiförbrukningen i vila hos människor vid kall exponering (för en genomgång, se Van Schaik et al.8). Studier av BAT:s fysiologi och inverkan på människors hälsa och sjukdomar begränsas för närvarande av protokollbegränsningar. Det är därför viktigt att ha en korrekt metod för att mäta den verkliga metaboliska effekten av BAT för att bättre förstå effekten av BAT-termogenes på fetma och dess metaboliska komplikationer hos människor.
Den anatomiska fördelningen av humant BAT gör det svårt att få noggranna mätningar av BAT. Hos människor fördelas BAT inuti WAT:s depåer i buken, bröstkorgen och, framför allt, halsen9. Obduktions- och kadaveriska studier har använts för att karakterisera BAT anatomiskt10,11, men dessa metoder kan inte ge funktionell information. Det är svårt att särskilja BAT med konventionella avbildningstekniker på grund av liknande densiteter för WAT och BAT8. En ytterligare förvirrande fråga är att beige fettdepåer också ligger inom samma smala lager av fascia eller i vissa depåer med WAT8, vilket gör det svårt att skilja med konventionella bildtekniker.
För att lösa detta problem mäts BAT-volymen vanligtvis genom att kombinera positronemissionstomografi (PET) och datortomografi (CT). Den radioaktivt märkta glukosanalogen 18 F-fluourodeoxiglukos (18F-FDG) är det vanligaste spårämnet som används för att studera BAT 12. Det lider emellertid av flera begränsningar, som att utsätta ämnen för joniserande strålning och vara invasiv och dyr. Dessutom är den största begränsningen hos spårämnet 18F-FDG att det mäter upptaget av en glukosanalog, vilket inte är idealiskt med tanke på att fria fettsyror är de föredragna substraten för BAT-termogenes13. 18F-FDG PET/CT-tekniken mäter inte upptaget av fria fettsyror som substrat för termogenes och mäter därför inte den fysiologiska betydelsen av BAT-termogenesen. Det finns alternativa tekniker som används för att bedöma human BAT, som inkluderar mätning av upptaget av syre-15-märkt vatten (15O-O2) 14,11 C-acetat 15, en långkedjig fettsyra (18 F-fluor-6-tia-heptadekansyra)16 eller adenosin 17, samt magnetisk resonansspektroskopi 18 och magnetisk resonanstomografi 19, men dessa är fortfarande extremt dyra och utsätter ämnen för joniserande strålning. Därför saknas en tillförlitlig, billig och viktigare, säker guldstandard för kvantifiering av humant BAT.
Infraröd termografi (IRT) är en alternativ icke-invasiv bildteknik20,21 som mäter hudtemperaturen över en känd BAT-depå. Även om detta leder till ökad energiförbrukning, om den uppmätta temperaturen inte överstiger kärntemperaturen, kan det inte bestämmas om den uppmätta temperaturförändringen helt enkelt är en följd av förändrat blodflöde. Vidare ger en uppmätt ökning av lokal temperatur inte värden på förändrad energiförbrukning, vilket ofta är den önskade slutpunkten. Ett antal forskargrupper har använt IRT för att mäta en temperaturökning i depåer av human BAT efter en koffeinintervention eller kall stimulans; Denna depå är supraklavikulär fossa 22,23,24,25,26,27.
Det är dock inte klart om koffeinets verkan på BAT är direkt eller medierad via neurala kretsar. Det finns bevis för att koffein inducerar brunfärgningsegenskaper i adipocyter in vitro22, och tidigare arbete har visat att koffein (100 mg) ökar hjärtfrekvensvariationen, vilket kan vara en indikator på en ökning av sympatisk nervdrift systemiskt i kroppen27. Detta är i linje med bevis hos gnagare, där koffein via centrala nervsystemet ökar termogenesen utan en negativ hjärtdynamisk inverkan28.
Eftersom det föredragna substratet för BAT-termogenes är fria fettsyror härledda från triglycerider13 och aktiva BAT-sekvestrar som cirkulerar lipider för att upprätthålla termogenes29, är mått på substratutnyttjande viktiga vid bedömning av fysiologisk aktivering av BAT. Andningsutbytesförhållandet (RER) är förhållandet mellan volymen syre som förbrukas (V̇O2) och producerad koldioxid (V̇CO2)30. En RER på 0,7 indikerar fettsyrametabolism, och en RER på 1,0 indikerar kolhydratmetabolism31. Därför är bevis på en preferens för fettsyrautnyttjande utöver en ökning av energiförbrukningen ett viktigt korrelat för BAT-termogenesen.
Dessutom, med tanke på att upptaget av glukos är ett känt korrelat till BAT-aktivitet (se ovan), är en minskning av blodglukos parallellt med förändringen i substratutnyttjande viktiga korrelat för BAT-termogenesen. Tidigare studier som enbart använt indirekt kalorimetri, eller tillsammans med temperaturregistrering hos fastande individer, har rapporterat liten eller ingen akut förändring i substratutnyttjande32,33. Eftersom detta sannolikt maskeras av fastande tillstånd (där preabsorptiv metabolism gynnar fettutnyttjande), föreslår vi att man kombinerar IRT och indirekt kalorimetri med kolhydratbelastning.
Denna artikel syftar till att tillhandahålla en steg-för-steg-metod som kliniska forskare kan använda för att på ett tillförlitligt och, viktigare, säkert kvantifiera den fysiologiska betydelsen av BAT hos människor genom att kombinera IRT, indirekt kalorimetri och blodsockernivåer. Denna teknik används bäst efter att försökspersonerna har blivit kolhydratladdade och exponerats för antingen farmakologiska BAT-medel eller miljöstimuli. Resultaten av denna metod kan användas för att studera BAT-aktivitet, substratanvändning och energiförbrukning efter aktivering av BAT hos enskilda försökspersoner27.
Metoden vi har visat här är ett tekniskt enkelt, säkert och kostnadseffektivt protokoll för mätning av BAT-termogenes hos människor. Protokollet behandlar farhågor relaterade till tillförlitligheten av att använda IRT på egen hand för att skilja mellan lokal uppvärmning på grund av förändrat hudblodflöde och djupare uppvärmning på grund av termogenes genom att korrelera IRT med både mått på energiförbrukning (EE) och substratutnyttjande. Eftersom denna teknik inte använder joniserande strålning tillåter den analys av upprepade åtgärder, vilket inte är möjligt med PET-avbildningstekniker. Slutligen, medan PET-avbildningstekniker kan identifiera BAT-aktivering, rapporterar de inte om de fysiologiska resultaten (ökad temperatur och EE) som detta protokoll mäter.
Styrkan i det protokoll som beskrivs här är att det finns fyra bevislinjer som stöder slutsatsen av framkallad BAT-termogenes: (1) ökad uppmätt Tscf, parallellt med oförändrad kärntemperatur och stabil hudtemperatur över det angränsande referensområdet; (2) ökade energiutgifter; (3) en förändring i substratutnyttjandet; och (4) en minskning av blodsockernivån. De konvergerande observationerna överensstämmer alla med de förväntade resultaten för BAT-termogenesen. Den väsentliga delen av protokollet är deltagarnas kolhydratbelastning för att säkerställa kolhydratmetabolism före intervention. BAT-termogenes växlar substratmetabolism från kolhydrater till fria fettsyror, vilket framgår av minskningen av RER. Medan det föredragna substratet för BAT-termogenes är fria fettsyror, är ett signifikant upptag av glukos till aktiv BAT väl etablerat 5,6,7. Därför observerar vi en minskning av blodsockernivån samtidigt med BAT-termogenesen. Det skulle inte vara möjligt att observera den ömsesidiga förändringen i substratutnyttjande (RER) och fallet i blodsockernivån i fastande tillstånd.
Tidigare studier har dragit slutsatsen att förhöjt Tscf (mätt med IRT) är tillräckligt för att dra slutsatsen om BAT-termogenesen. Denna slutsats är dock endast säker om Tscf överstiger kärntemperaturen. Om Tscf är mindre än eller lika med kärntemperaturen, kan en lokal temperaturförändring på grund av ökat hudblodflöde inte uteslutas. En systematisk genomgång drog slutsatsen att IRT ensamt inte kan avgöra om ökningar av supraklavikulär hudtemperatur beror på BAT-termogenes37. I granskningen noterades att den vanligaste metoden (18F-FDG PET/CT) mäter upptaget av glukos i BAT37. Det föredragna substratet för BAT-termogenes är dock fettsyror13. Detta metodologiska problem förhindrar en meningsfull jämförelse mellan PET/CT-data vid validering av IRT-data, eftersom inget av dessa mått ensamt är ett lämpligt mått på BAT:s verkliga metaboliska aktivitet eftersom det inte kan indikera förändringen i energiförbrukning och substratanvändning på grund av BAT-termogenesen. Men med det protokoll som beskrivs här kan vi inte bara kvantifiera temperaturförändringen, utan vi kan också bekräfta en ökning av energiförbrukningen – ett viktigt fysiologiskt resultat av BAT-termogenesen. IRT är en beröringsfri, icke-invasiv och relativt billig metod för att mäta temperatur- och temperaturförändringar i samband med BAT-termogenes. Däremot är PET-CT dyrt och utsätter individer för joniserande strålning, vilket begränsar tillämpligheten av denna metod till små retrospektiva analyser av kliniska avbildningsstudier. Tillämpningen av det nuvarande protokollet på storskaliga, randomiserade kliniska prövningar skulle vara relativt enkel och kostnadseffektiv.
Det är viktigt att notera att minskningen av kolhydratoxidation efter koffeinintervention kan förklaras av förändringen i substratutnyttjande som ett resultat av ökad BAT-termogenes på grund av interventionen. Åtgärder av insulinsignalering skulle göra resultaten av denna studie mer robusta. Baserat på resultaten av denna studie är det dock inte klart om koffein skulle påverka insulinsignalering via verkan på BAT eller om sänkningen av blodsockret är ett resultat av att BAT tar upp fler energisubstrat.
18F-FDG PET/CT-metoden har flera inneboende begränsningar när den används för att kvantifiera och mäta den fysiologiska aktiviteten hos bästa tillgängliga teknik, särskilt när man undersöker näringsämnens eller dietingrediensers inverkan på BAT-aktiviteten. 18F-FDG PET/CT-metoden kräver att försökspersonerna fastar för att undvika utfodringsinducerade ökningar av glukosupptaget i muskelvävnaden, vilket avsevärt kan minska detekteringen av både BAT- och BAT-funktionen38. Dessutom kan denna teknik inte ensam mäta den fysiologiska effekten eller omfattningen av BAT-aktivering. Dessutom är användningen av joniserande strålning i PET-avbildningsstudier ett etiskt hinder och hälso- och säkerhetshinder för att utforma cross-over-studier med upprepade åtgärder. Dessutom representerar 18F-FDG endast glukosupptag, vilket inte är detsamma som att mäta glukosmetabolism. Denna metod för kolhydratbelastning av försökspersoner före mätning av BAT-temperaturen och kombination av blodsockernivåer med indirekt kalorimetri gör det möjligt för oss att noggrant mäta den fysiologiska effekten av termogenes och förändrat substratutnyttjande, vilket annars inte skulle vara tillgängligt i fastande tillstånd.
Styrkor och begränsningar
Detta protokoll har större konsekvenser än att bara studera bästa tillgängliga teknik. Genom kolhydratbelastningsdeltagare före intervention kan oscillationen av blodsockernivåer som svar på både kolhydratbelastning och koffeinintervention, liksom förändringar i substratutnyttjande, observeras. Därför kan denna teknik användas för att förbättra humana indirekta kalorimetristudier och metaboliska åtgärder. Det är ännu inte känt om resultaten från denna studie kan replikeras efter andra ingrepp, såsom kall exponering eller adrenerg stimulering. Emellertid, resultaten av denna studie har replikerats efter intervention med en annan kosten ingrediens, nämligen Capsicum annuum27. Ytterligare noggrannhet och förtroende för resultaten skulle kunna uppnås med hjälp av en dubbelblind metod för analys av insatser med hjälp av de beskrivna teknikerna, och detta skulle lätt kunna genomföras27.
Den potentiella förvirringen av varierad rumstemperatur är inte relevant i detta protokoll, eftersom rumstemperaturen hölls stabil från deltagare till deltagare. Dessutom beaktades fuktigheten under kalibreringen av andningsgasanalysatorn. Detta antyds i installationen av denna utrustning, eftersom kalibreringen slutförs enligt tillverkarens instruktioner.
Tidsintervallen för mätning och behandling bestämdes efter en mindre pilotstudie där felsökning av protokollet genomfördes. I huvudsak bestämdes tidsintervallen för mätning utifrån den tid som behövs för forskaren att utföra mätningarna och för deltagarens komfort. Tidpunkten för interventionen bestämdes utifrån den tid det tog för kolhydratmetabolism att inträffa efter kolhydratbelastningen för att undersöka om interventionen ökade oxidationen av fria fettsyror (dvs BAT-termogenesen) och sänkte kolhydratoxidationen.
I synnerhet finns det skillnader mellan kapillär- och venösa glukosnivåer39. Men i samband med vård utanför sjukhus är det vanligaste sättet att mäta blodsockernivån via ett blodprov av kapillärursprung analyserat av en handhållen, patientnära glukometer40. Dessutom, hos friska individer (liknande de som ingår i detta protokoll) i en icke-klinisk miljö, finns det en statistiskt signifikant, men inte kliniskt signifikant, skillnad mellan kapillär- och venösa blodsockernivåer mätt med hjälp av en kapillärbaserad glukometer41. I detta sammanhang skulle kapillärprovtagning förbli det optimala tillvägagångssättet på grund av att de flesta patientnära glukometrar som finns tillgängliga på marknaden är konstruerade för att analysera kapillärblodprover41. Ur ett kliniskt perspektiv kan man hävda att venöst blodsocker är den överlägsna analysmetoden. Venös blodprovtagning är dock inte bara dyr och kräver specialutrustning (ibid), men det är också invasivt. De etiska övervägandena om att öka risken för biverkningar under protokollet måste vägas mot den rapporterade litteraturen som visar den höga korrelationen och tillförlitligheten hos kapillärblodglukos som ett proxymått på venöst blodsocker42. Nyckeln här är naturligtvis att vi inte har föresatt oss att diagnostisera diabetes utan att mäta förändringar i blodsockernivåer, för vilka kapillär blodsockerövervakning är ett mer än lämpligt protokoll.
Glukos kan inducera termogenes och enstaka måltider kan aktivera BAT43. Emellertid, och snarare viktigt, visar data som ingår i detta manuskript ingen signifikant effekt av glukosbelastning i interventionsgruppen eller placebogruppen. Dessutom härrörde uppgifterna i manuskriptet från resultaten från Van Schaik m.fl., som omfattade en tredje intervention (Capsicum annuum), och glukosbelastningen hade ingen signifikant effekt på åtgärderna27.
Det bör noteras att detta protokoll endast har använts hos manliga deltagare med lågt kroppsfett och aktiv BAT (för att minska antalet kontrollerbara variabler uteslöts kvinnor från studien). Det finns en känd omvänd korrelation mellan fetthalt och BAT-massa hos människa44. Dessutom är det känt att tidigare överviktiga människor som har gått ner i vikt genom kost och motion har en lägre basal ämnesomsättning och måste konsumera dieter med lägre kalorier för att bibehålla en normal vikt45,46. Dessutom kan BAT-aktivitet stimulera BAT-tillväxt8. Den metod som beskrivs här kommer att möjliggöra långtidsstudier för att undersöka förändringar i BAT-aktivitet i samband med metabola sjukdomar på ett sätt som inte ges av andra tekniker.
Slutsats
Sammanfattningsvis demonstrerar vi en mätmetod för att kvantifiera human brun fettvävnadsaktivitet med hjälp av IRT och indirekt kalorimetri efter en kolhydratbelastning. De kritiska stegen inkluderar 1) kolhydratbelastning av deltagarna som är i fastande tillstånd före mätning av BAT-temperaturen samtidigt som indirekta kalorimetri- och blodsockernivåer kombineras för att möjliggöra kvantifiering av den fysiologiska omfattningen av BAT-termogenes och förändrat substratutnyttjande; 2) bedöma relevanta BAT-depåer och temperaturer för IRT från en referenspunkt och kärntemperatur för att påvisa varje ökning av Tscf som skulle tyda på BAT-aktivering baserat på den anatomiska platsen. Vi anser att dessa kvantitativa mätningar möjliggör en mer exakt utvärdering av BAT:s bidrag till människans energimetabolism och termoregulering hos vuxna. Detta grundliga tillvägagångssätt bör användas av forskare för att studera BAT-fysiologi och fungera som en ny standard för utveckling av humana BAT-aktiveringsmetoder i framtiden.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka alla studievolontärer för deras deltagande i vår studie. Detta arbete stöddes av Holsworth Research Initiative, La Trobe University och Defence Science Institute (DSI, Australien).
Automated Sphygmomanometer | Omron SEM-2 advanced, Omron, Kyoto, Japan | ||
Dual-energy X-ray absorptiometry scanner | Hologic Horizon, Hologic Inc., Bedford, MA, USA | ||
ECG electrodes | Ambu Blue Sensor R, Malaysia | ||
Five lead ECG | Medilog AR12 plus; Schiller, Germany | ||
FLIR E60 camera | FLIR Systems Australia, Melbourne , Australia | ||
FLIR Research Studio Professional Edition | FLIR Systems Australia, Melbourne , Australia | ||
Freestyle Optium Xceed | Abbott Diabetes Care, Alameda, Canada | ||
Glucose Gel | Winners Sports Nutrition, Mt Martha, Victoria, Australia | ||
MaskA cold-sterilized silicone mask | 7400 series Oro-Nasal Mask, Hans Rudolph | ||
Medilog Darwin2 software | Professional; Schiller, Germany | ||
Non-contact Infrared Thermometer | Berrcom, JXB-178, Guangdong, China | ||
Optium Glucose Strip Xceed | Abbott Diabetes Care, Alameda, Canada | ||
ParvoMedics TrueOne 2400 respiratory gas analyser | ParvoMedics Inc, East Sandy, UT, USA | ||
Pre-sterilized Non-rebreathing Valve | Two-way non-rebreathing valve T-Shape configuration, 2600 Medium or 2700 Large, Hans Rudolph |