Bandas Aórticas O-Ring versus Constrição Aórtica Transversa Tradicional para Modelagem da Hipertrofia Cardíaca Induzida por Sobrecarga de Pressão
Summary
O presente protocolo descreve uma nova técnica de bandagem aórtica em camundongos para induzir hipertrofia cardíaca por sobrecarga pressórica. Para bandas, um anel de borracha com um diâmetro interno fixo é usado. Esta nova técnica promete menos variância e mais dados reprodutíveis para experimentos futuros.
Abstract
A banda aórtica em camundongos é um dos modelos experimentais mais comumente utilizados para hipertrofia cardíaca induzida por sobrecarga de pressão cardíaca e indução de insuficiência cardíaca. A técnica utilizada anteriormente é baseada em uma sutura rosqueada ao redor do arco aórtico amarrada sobre uma agulha 27 G embotada para criar estenose. Este método depende do cirurgião apertar manualmente a rosca e, assim, leva a uma alta variância no tamanho do diâmetro. Um método recém-refinado descrito por Melleby et al. promete menor variância e mais reprodutibilidade após a cirurgia. A nova técnica, a bandagem o-ring-aórtica (ORAB), usa um anel de borracha antiderrapante em vez de uma sutura com um fio, resultando em variação reduzida na sobrecarga de pressão e fenótipos reprodutíveis de hipertrofia cardíaca. Durante a cirurgia, o o-ring é colocado entre as artérias braquiocefálica e carótida esquerda. A constrição bem-sucedida é confirmada pela ecocardiografia. Após 1 dia, a colocação correta do anel resulta em um aumento da velocidade de fluxo na aorta transversal sobre a estenose induzida pelo anel o. Após 2 semanas, a função cardíaca prejudicada é comprovada pela diminuição da fração de ejeção e aumento da espessura da parede. É importante ressaltar que, além de menor variância no tamanho do diâmetro, o ORAB está associado a menores taxas de mortalidade intra e pós-operatórias em comparação com a constrição aórtica transversa (TAC). Assim, o ORAB representa um método superior à cirurgia TAC comumente utilizada, resultando em resultados mais reprodutíveis e uma possível redução no número de animais necessários.
Introduction
Embora a hipertrofia cardíaca fisiológica possa ser observada durante o desenvolvimento, o exercício e a gravidez, a hipertrofia cardíaca patológica responde a condições de estresse hemodinâmico, como hipertensão arterial, doença cardíaca valvar ou mutações genéticas. Inicialmente, o coração passa por um remodelamento caracterizado pelo aumento do tamanho dos cardiomiócitos e espessamento das paredes ventriculares para manter a função cardíaca 1,2. Por outro lado, o remodelamento cardíaco patológico está associado a um risco aumentado de arritmia, morte súbita e alta mortalidade. Finalmente, com o tempo, resulta em dilatação ventricular, forte diminuição da função contrátil e eventual progressão para insuficiência cardíaca (IC), que está associada a altos custos de morbidade, mortalidade e sociais3. Portanto, há uma necessidade urgente de compreender o fundo molecular para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas4.
A bandagem aórtica é um modelo que imita a hipertrofia do ventrículo esquerdo (VE) induzida pela sobrecarga de pressão e a insuficiência cardíaca em camundongos5. Com este método, é possível examinar in vivo os patomecanismos do remodelamento cardíaco induzido pela sobrecarga pressórica. O primeiro procedimento de bandagem aórtica em camundongos foi relatado por Rockman et al.6. A sobrecarga de pressão é induzida por uma ligadura baseada em sutura de fio ao redor da aorta (entre a artéria carótida comum braquiocefálica e esquerda). Para criar uma estenose de 0,4 mm de diâmetro, uma sutura é colocada em torno de uma agulha de 27 G e da aorta. Após a ligadura, a agulha é removida 6,7.
Mesmo que o diâmetro da agulha seja fixo, o aperto da linha é altamente dependente do cirurgião e, portanto, afeta o fenótipo induzido da hipertrofia cardíaca. Além disso, no método baseado em fio/sutura, há um grau variável de diâmetro da estenose após a cirurgia, associado a uma alta variância na mortalidade 8,9. Além disso, treinar esse método é um desafio, especialmente no que diz respeito a encontrar o nível certo e a consistência no aperto do fio. Finalmente, no início do treinamento, ocorre alta mortalidade intra e pós-operatória devido à ruptura da aorta ou outra lesão tecidual, bem como alta variação na extensão da estenose nos animais sobreviventes.
Recentemente, um procedimento otimizado de bandagem aórtica foi descrito por Melleby et al.10. Eles apresentaram o método ORAB (o-ring aortic banding) com menor variância na estenose e níveis altamente reprodutíveis de sobrecarga de pressão usando um o-ring de borracha antiderrapante com diâmetro interno fixo de 0,71 mm, 0,66 mm e 0,61 mm. Em suma, o o-ring é cortado aberto, colocado ao redor do arco ascendente e fechado novamente por fios. Outros cientistas que utilizaram esses o-rings relataram menor variabilidade na hipertrofia cardíaca induzida9. Observaram também mortalidade intra e pós-operatória, bem como melhor reprodutibilidade e menor variância no fenótipo hipertrófico induzido 9,11. O presente artigo descreve o procedimento dessa estratégia exclusiva em um protocolo passo a passo. A experiência partilhada neste relatório ajudará outros cientistas a melhorar as suas técnicas nesta área.
Para induzir hipertrofia cardíaca resultando em insuficiência cardíaca após 6 semanas, camundongos machos C57BL/6N de 12 semanas de idade são recomendados para cirurgia. Uma comparação 2 semanas após a bandagem aórtica entre as subcepas de camundongos C57BL/6N e C57BL/6J mostrou disfunção cardíaca grave e aumento da mortalidade associada em camundongos C57BL/6N. Portanto, estes são mais adequados para modelos de insuficiência cardíaca12. Camundongos machos e fêmeas de doze semanas de idade têm um tamanho ideal para a exposição da aorta e colocação do o-ring com instrumentos especiais.
Protocol
Representative Results
Discussion
A bandagem aórtica baseada em fio/sutura tem sido usada há muitos anos para induzir hipertrofia cardíaca por sobrecarga de pressão em camundongos. É um método estabelecido para investigar os patomecanismos de remodelamento cardíaco e progressão da doença in vivo. As limitações são a variância relativamente alta no grau de estenose e, consequentemente, o remodelamento. A técnica ORAB recentemente introduzida, descrita pela primeira vez por Melleby et al.10 , otimiza o métod…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) para L.L., N.F. e O.J.M. (IVOLADMT-HF; FKZ 01KC2006A).
Materials
| 1 x long Fixators, 6 cm | 18200-01 | ||
| 2 x Blunt Retractors, 5 mm wide | 18200-11 | ||
| 2 x Short Fixators, 3 cm | 18200-02 | ||
| 2 x fine tip 45° angled forceps | FST (fine sience tools) | 11160-10 | |
| 3 x Blunt Retractors, 2.5 mm wide | 18200-10 | ||
| 3 x Retractor Wires | 18200-05 | ||
| 4-0 absorbable suture (Vicryl) | ETHICON | SABBKLT0 | Used to suture skin |
| 6-0 suture (Prolene), needle size:13 mm | ETHICON | JDP879 | Used to suture chest muscle |
| 8-0 suture (Prolene), needle size: 6.5 mm | ETHICON | RHBECH | Used to fast the Ring |
| Anesthetizing Box, Small | Havard apparatus | 50-0108 | |
| C57BL/6N mice | Charles River | ||
| Fluosorber Activated Charcoal Filter Canister | Havard apparatus | 34-0415 | Used to induce and maintain anesthesia |
| Handmade laryngsopcope | Intubationshelp | ||
| Harvard Apparatus Anesthetic Vaporizer | Havard apparatus | Used to induce and maintain anesthesia | |
| Heating pad + rectal probe (LSI Letica Scientific Instruments:Temperature control unit HB 101/2 ) | Panlab/ Havard apparatus | Used to control and maintain body temperature | |
| i.v. cannula blue 22-gauge (Vasofix Braunüle 0.9 x 25 mm) | B/Braunsharing Expertise | 4268091B | intubation |
| isofluran | Baxter | Anesthesia | |
| Kodan (betadine solution) | Schülke | 20003960-A | Desinfection |
| ligation aid | FST (fine sience tools) | 18062-12 | Used to perform liagtion with O-ring |
| Microscope Lighting: Schott VisiLED Set MC1500/S80-55 (+ controller) | SCHOTT | Ligth | |
| Microscope camera (Leica IC80 HD) | Leica | Used for visualiation operating field | |
| MiniVac Complete Anesthesia Systems for small rodents | Havard apparatus | 75-0233 | Used to induce and maintain anesthesia |
| Mouse Ventilator MiniVent Type 845 | Havard Apparatus | 73-0044 | Used to ventilation during surgery |
| Needle holder | FST (fine sience tools) | TE-10804 | |
| O-ring, non-slip rubber (0.0018 mm x 0.020 mm) | Apple Rubber Products | Liagtion of the aortic arch | |
| Scissors | FST (fine sience tools) | 14040-09 | Used to cut the skin and threads |
| Small Animal Retraction System (Kit for Animals up to 200 g) | FST (fine sience tools) | 18200-20 | |
| Small Base Plate, 20 x 30 cm | 18200-03 | ||
| Table intgerated with heating pad + rectal probe + ECG and transducer tripod | FujiFilm Visual Sonics Imaging System | Echocardiography | |
| Temgesic (Buprenorphin) | Indivior UK Limited | 997.00.00 | Pain pre-medication |
| three-way stop cock (blue) | |||
| Tramal (Tamadol) | Grünental | Pain post-medication | |
| transducer probe MS400 (Visual Sonics) | FujiFilm Visual Sonics Imaging System | Echocardiography | |
| Ultrasound system with cardioligy package | FujiFilm Visual Sonics Imaging System | Echocardiography | |
| Vannas Spring Scissors – 2.5 mm Cutting Edge | FST (fine sience tools) | 15000-08 | Used to cut intercostal chest muscle |
| vet ointment | Bepanten | Used to prevent eyes from drying out |
Referências
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