Уплотнительное кольцо аортального бандажа в сравнении с традиционным поперечным сужением аорты для моделирования гипертрофии сердца, вызванной перегрузкой давления
Summary
Настоящий протокол описывает новую технику полосирования аорты у мышей, чтобы вызвать перегрузку давлением сердечной гипертрофии. Для обвязки используется резиновое кольцо с фиксированным внутренним диаметром. Этот новый метод обещает меньшую дисперсию и более воспроизводимые данные для будущих экспериментов.
Abstract
Полосатость аорты у мышей является одной из наиболее часто используемых экспериментальных моделей гипертрофии сердца, вызванной перегрузкой сердечного давления, и индукции сердечной недостаточности. Ранее используемая техника основана на резьбовом шве вокруг дуги аорты, перевязанной поверх притупленной иглы 27 G для создания стеноза. Этот метод зависит от того, вручную ли хирург затягивает нить и, таким образом, приводит к высокой дисперсии в размере диаметра. Недавно усовершенствованный метод, описанный Melleby et al., обещает меньшую дисперсию и большую воспроизводимость после операции. Новая методика, уплотнительное кольцо-аортальное бандажирование (ORAB), использует нескользящее резиновое кольцо вместо шва с резьбой, что приводит к уменьшению вариации перегрузки давлением и воспроизводимым фенотипам гипертрофии сердца. Во время операции уплотнительное кольцо помещается между брахиоцефальной и левой сонной артериями. Успешное сужение подтверждается эхокардиографией. Через 1 день правильное размещение кольца приводит к увеличению скорости потока в поперечной аорте по сравнению со стенозом, вызванным уплотнительным кольцом. Через 2 недели нарушение сердечной функции подтверждается уменьшением фракции выброса и увеличением толщины стенки. Важно отметить, что помимо меньшей дисперсии в размере диаметра, ORAB связан с более низкими показателями внутри- и послеоперационной смертности по сравнению с поперечным сужением аорты (TAC). Таким образом, ORAB представляет собой превосходный метод по сравнению с широко используемой хирургией TAC, что приводит к более воспроизводимым результатам и возможному сокращению количества необходимых животных.
Introduction
В то время как физиологическая гипертрофия сердца может наблюдаться во время развития, физических упражнений и беременности, патологическая гипертрофия сердца реагирует на гемодинамические стрессовые состояния, такие как артериальная гипертензия, порок клапанов сердца или генные мутации. Первоначально сердце подвергается ремоделированию, характеризующемуся увеличением размера кардиомиоцитов и утолщением стенок желудочков для поддержания сердечной функции 1,2. С другой стороны, патологическое ремоделирование сердца связано с повышенным риском развития аритмии, внезапной смерти и высокой смертности. Наконец, со временем это приводит к расширению желудочков, сильному снижению сократительной функции и возможному прогрессированию сердечной недостаточности (HF), что связано с высокой заболеваемостью, смертностью и социальными издержками3. Поэтому существует острая необходимость в понимании молекулярного фона для разработки новых терапевтических стратегий4.
Полосатость аорты представляет собой модель, которая имитирует гипертрофию левого желудочка (ЛЖ), вызванную перегрузкой давления, и сердечную недостаточность у мышей5. С помощью этого метода можно исследовать патомеханизмы вызванного перегрузкой давления ремоделирования сердца in vivo. О первой процедуре полосирования аорты у мышей сообщили Rockman et al.6. Перегрузка давлением индуцируется перевязкой на основе шва нити вокруг аорты (между брахиоцефальной и левой общей сонной артерией). Для создания стеноза диаметром 0,4 мм вокруг иглы 27 Г и аорты накладывается шов. После перевязки иглу удаляют 6,7.
Несмотря на то, что диаметр иглы фиксирован, герметичность нити сильно зависит от хирурга и, следовательно, влияет на индуцированный фенотип гипертрофии сердца. Кроме того, в методе на основе резьбы/шва существует переменная степень диаметра стеноза после операции, связанная с высокой дисперсией смертности 8,9. Кроме того, обучение этому методу является сложной задачей, особенно в отношении поиска нужного уровня и последовательности в затягивании нити. Наконец, в начале обучения возникает высокая внутри- и послеоперационная смертность из-за нарушения работы аорты или другого повреждения тканей, а также высокая вариативность степени стеноза у выживших животных.
Недавно оптимизированная процедура полосирования аорты была описана Melleby et al.10. Они представили метод ORAB (уплотнительное кольцо аортальной полосы) с меньшей дисперсией в стенозе и высоковоспроизводимыми уровнями перегрузки давлением с использованием нескользящего резинового уплотнительного кольца с фиксированным внутренним диаметром 0,71 мм, 0,66 мм и 0,61 мм. Короче говоря, уплотнительное кольцо разрезается, помещается вокруг восходящей арки и снова закрывается нитями. Другие ученые, использующие эти уплотнительные кольца, сообщили о меньшей вариабельности индуцированной гипертрофии сердца9. Они также наблюдали интра- и послеоперационную смертность, а также лучшую воспроизводимость и меньшую дисперсию в индуцированном гипертрофическом фенотипе 9,11. В настоящей статье описана процедура реализации этой уникальной стратегии в пошаговом протоколе. Опыт, которым поделился в этом отчете, поможет другим ученым улучшить свои методы в этой области.
Чтобы вызвать гипертрофию сердца, приводящую к сердечной недостаточности через 6 недель, 12-недельные мыши C57BL / 6N мужского пола рекомендуются для операции. Сравнение через 2 недели после полосирования аорты между подстренами мышей C57BL/6N и C57BL/6J показало тяжелую сердечную дисфункцию и связанную с ней повышенную смертность у мышей C57BL/6N. Поэтому они лучше подходят для моделей сердечной недостаточности12. Двенадцатинедельные самцы и самки мышей имеют оптимальный размер для обнажения аорты и размещения уплотнительного кольца специальными инструментами.
Protocol
Representative Results
Discussion
Полосатость аорты на основе нитей / швов использовалась в течение многих лет, чтобы вызвать гипертрофию сердца при перегрузке давлением у мышей. Это устоявшийся метод исследования патомеханизмов ремоделирования сердца и прогрессирования заболевания in vivo. Ограничениями являются…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) для L.L., N.F. и O.J.M. (IVOLADMT-HF; ФКЗ 01КЦ2006А).
Materials
| 1 x long Fixators, 6 cm | 18200-01 | ||
| 2 x Blunt Retractors, 5 mm wide | 18200-11 | ||
| 2 x Short Fixators, 3 cm | 18200-02 | ||
| 2 x fine tip 45° angled forceps | FST (fine sience tools) | 11160-10 | |
| 3 x Blunt Retractors, 2.5 mm wide | 18200-10 | ||
| 3 x Retractor Wires | 18200-05 | ||
| 4-0 absorbable suture (Vicryl) | ETHICON | SABBKLT0 | Used to suture skin |
| 6-0 suture (Prolene), needle size:13 mm | ETHICON | JDP879 | Used to suture chest muscle |
| 8-0 suture (Prolene), needle size: 6.5 mm | ETHICON | RHBECH | Used to fast the Ring |
| Anesthetizing Box, Small | Havard apparatus | 50-0108 | |
| C57BL/6N mice | Charles River | ||
| Fluosorber Activated Charcoal Filter Canister | Havard apparatus | 34-0415 | Used to induce and maintain anesthesia |
| Handmade laryngsopcope | Intubationshelp | ||
| Harvard Apparatus Anesthetic Vaporizer | Havard apparatus | Used to induce and maintain anesthesia | |
| Heating pad + rectal probe (LSI Letica Scientific Instruments:Temperature control unit HB 101/2 ) | Panlab/ Havard apparatus | Used to control and maintain body temperature | |
| i.v. cannula blue 22-gauge (Vasofix Braunüle 0.9 x 25 mm) | B/Braunsharing Expertise | 4268091B | intubation |
| isofluran | Baxter | Anesthesia | |
| Kodan (betadine solution) | Schülke | 20003960-A | Desinfection |
| ligation aid | FST (fine sience tools) | 18062-12 | Used to perform liagtion with O-ring |
| Microscope Lighting: Schott VisiLED Set MC1500/S80-55 (+ controller) | SCHOTT | Ligth | |
| Microscope camera (Leica IC80 HD) | Leica | Used for visualiation operating field | |
| MiniVac Complete Anesthesia Systems for small rodents | Havard apparatus | 75-0233 | Used to induce and maintain anesthesia |
| Mouse Ventilator MiniVent Type 845 | Havard Apparatus | 73-0044 | Used to ventilation during surgery |
| Needle holder | FST (fine sience tools) | TE-10804 | |
| O-ring, non-slip rubber (0.0018 mm x 0.020 mm) | Apple Rubber Products | Liagtion of the aortic arch | |
| Scissors | FST (fine sience tools) | 14040-09 | Used to cut the skin and threads |
| Small Animal Retraction System (Kit for Animals up to 200 g) | FST (fine sience tools) | 18200-20 | |
| Small Base Plate, 20 x 30 cm | 18200-03 | ||
| Table intgerated with heating pad + rectal probe + ECG and transducer tripod | FujiFilm Visual Sonics Imaging System | Echocardiography | |
| Temgesic (Buprenorphin) | Indivior UK Limited | 997.00.00 | Pain pre-medication |
| three-way stop cock (blue) | |||
| Tramal (Tamadol) | Grünental | Pain post-medication | |
| transducer probe MS400 (Visual Sonics) | FujiFilm Visual Sonics Imaging System | Echocardiography | |
| Ultrasound system with cardioligy package | FujiFilm Visual Sonics Imaging System | Echocardiography | |
| Vannas Spring Scissors – 2.5 mm Cutting Edge | FST (fine sience tools) | 15000-08 | Used to cut intercostal chest muscle |
| vet ointment | Bepanten | Used to prevent eyes from drying out |
Referências
- Frey, N., Olson, E. N. Cardiac hypertrophy: The good, the bad, and the ugly. Annual Review of Physiology. 65, 45-79 (2003).
- Bui, A. L., Horwich, T. B., Fonarow, G. C. Epidemiology and risk profile of heart failure. Nature Reviews Cardiology. 8 (1), 30-41 (2011).
- Bolli, R. New initiatives to improve the rigor and reproducibility of articles published in Circulation Research. Circulation Research. 121 (5), 472-479 (2017).
- Dunlay, S. M., Weston, S. A., Jacobsen, S. J., Roger, V. L. Risk factors for heart failure: A population-based case-control study. The American Journal of Medicine. 122 (11), 1023-1028 (2009).
- Riehle, C., Bauersachs, J. Small animal models of heart failure. Circulation Research. 115 (13), 1838-1849 (2019).
- Rockman, H. A., et al. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (18), 8277-8281 (1991).
- Hu, P., et al. Minimally invasive aortic banding in mice: effects of altered cardiomyocyte insulin signaling during pressure overload. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (3), 1261-1269 (2003).
- Mohammed, S. F., et al. Variable phenotype in murine transverse aortic constriction. Cardiovascular Pathology. 21 (3), 188-198 (2012).
- Nakao, Y., et al. O-ring-induced transverse aortic constriction (OTAC) is a new simple method to develop cardiac hypertrophy and heart failure in mice. Scientific Reports. 12, 85 (2022).
- Melleby, A. O., et al. A novel method for high precision aortic constriction that allows for generation of specific cardiac phenotypes in mice. Cardiovascular Research. 114 (12), 1680-1690 (2018).
- Lindsey, M. L., Kassiri, Z., Virag, J. A. I., de Castro Bras, L. E., Scherrer-Crosbie, M. Guidelines for measuring cardiac physiology in mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 314 (4), 733-752 (2018).
- Garcia-Menendez, L., Karamanlidis, G., Kolwicz, S., Tian, R. Substrain specific response to cardiac pressure overload in C57BL/6 mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (3), 397-402 (2013).
- deAlmeida, A. C., van Oort, R. J., Wehrens, X. H. Transverse aortic constriction in mice. Journal of Visualized Experiments. (38), e1729 (2010).
