Banda aórtica con junta tórica versus constricción aórtica transversal tradicional para el modelado de la hipertrofia cardíaca inducida por sobrecarga de presión
Summary
El presente protocolo describe una nueva técnica de banda aórtica en ratones para inducir hipertrofia cardíaca por sobrecarga de presión. Para el enfajado, se utiliza un anillo de goma con un diámetro interior fijo. Esta nueva técnica promete menos varianza y datos más reproducibles para futuros experimentos.
Abstract
La banda aórtica en ratones es uno de los modelos experimentales más utilizados para la hipertrofia cardíaca inducida por sobrecarga de presión cardíaca y la inducción de insuficiencia cardíaca. La técnica utilizada anteriormente se basa en una sutura roscada alrededor del arco aórtico atada sobre una aguja roma de 27 G para crear estenosis. Este método depende de que el cirujano apriete manualmente el hilo y, por lo tanto, conduce a una alta variación en el tamaño del diámetro. Un método recientemente refinado descrito por Melleby et al. promete menos varianza y más reproducibilidad después de la cirugía. La nueva técnica, la banda aórtica de junta tórica (ORAB), utiliza un anillo de goma antideslizante en lugar de una sutura con un hilo, lo que resulta en una variación reducida en la sobrecarga de presión y fenotipos reproducibles de hipertrofia cardíaca. Durante la cirugía, la junta tórica se coloca entre las arterias braquiocefálica y carótida izquierda. La constricción exitosa se confirma mediante ecocardiografía. Después de 1 día, la colocación correcta del anillo da como resultado un aumento de la velocidad de flujo en la aorta transversal sobre la estenosis inducida por la junta tórica. Después de 2 semanas, la función cardíaca deteriorada se demuestra por la disminución de la fracción de eyección y el aumento del grosor de la pared. Es importante destacar que, además de una menor varianza en el tamaño del diámetro, el ORAB se asocia con tasas de mortalidad intra y postoperatoria más bajas en comparación con la constricción aórtica transversa (TAC). Por lo tanto, ORAB representa un método superior a la cirugía TAC comúnmente utilizada, lo que resulta en resultados más reproducibles y una posible reducción en el número de animales necesarios.
Introduction
Mientras que la hipertrofia cardíaca fisiológica se puede observar durante el desarrollo, el ejercicio y el embarazo, la hipertrofia cardíaca patológica responde a condiciones de estrés hemodinámico como hipertensión arterial, enfermedad cardíaca valvular o mutaciones genéticas. Inicialmente, el corazón sufre una remodelación caracterizada por aumento del tamaño de los cardiomiocitos y engrosamiento de las paredes ventriculares para mantener la función cardíaca 1,2. Por otro lado, la remodelación cardíaca patológica se asocia con un mayor riesgo de arritmia, muerte súbita y alta mortalidad. Finalmente, con el tiempo, resulta en dilatación ventricular, fuerte disminución de la función contráctil y eventual progresión a insuficiencia cardíaca (IC), que se asocia con alta morbilidad, mortalidad y costos sociales3. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de comprender los antecedentes moleculares para desarrollar nuevas estrategias terapéuticas4.
La banda aórtica es un modelo que imita la hipertrofia ventricular izquierda (VI) inducida por sobrecarga de presión y la insuficiencia cardíaca en ratones5. Con este método, es posible examinar los mecanismos patológicos de la remodelación cardíaca inducida por sobrecarga de presión in vivo. El primer procedimiento de banda aórtica en ratones fue relatado por Rockman et al.6. La sobrecarga de presión es inducida por una ligadura basada en sutura de hilo alrededor de la aorta (entre la arteria braquiocefálica y la arteria carótida común izquierda). Para crear una estenosis de 0,4 mm de diámetro, se coloca una sutura alrededor de una aguja de 27 G y la aorta. Después de la ligadura, la aguja se retira 6,7.
Aunque el diámetro de la aguja es fijo, la estanqueidad del hilo depende en gran medida del cirujano y, por lo tanto, afecta el fenotipo inducido de hipertrofia cardíaca. Además, en el método basado en hilo/sutura, existe un grado variable de diámetro de estenosis después de la cirugía, asociado con una alta varianza en la mortalidad 8,9. Además, entrenar este método es un desafío, especialmente con respecto a encontrar el nivel y la consistencia adecuados para apretar el hilo. Finalmente, al comienzo del entrenamiento, se produce una alta mortalidad intra y postoperatoria debido a la interrupción de la aorta u otra lesión tisular, así como una alta variación en el grado de estenosis en los animales sobrevivientes.
Recientemente, Melleby et al.10 describieron un procedimiento optimizado de bandas aórticas. Presentaron el método ORAB (o-ring aortic banding) con menor varianza en la estenosis y niveles altamente reproducibles de sobrecarga de presión mediante el uso de una junta tórica de goma antideslizante con un diámetro interior fijo de 0,71 mm, 0,66 mm y 0,61 mm. En resumen, la junta tórica se corta, se coloca alrededor del arco ascendente y se cierra nuevamente con hilos. Otros científicos que utilizaron estas juntas tóricas reportaron menos variabilidad en la hipertrofia cardíaca inducida9. También observaron mortalidad intra y postoperatoria, así como mejor reproducibilidad y menor varianza en el fenotipo hipertrófico inducido 9,11. El presente artículo describe el procedimiento de esta estrategia única en un protocolo paso a paso. La experiencia compartida en este informe ayudará a otros científicos a mejorar sus técnicas en esta área.
Para inducir la hipertrofia cardíaca que resulta en insuficiencia cardíaca después de 6 semanas, se recomiendan ratones machos C57BL / 6N de 12 semanas de edad para la cirugía. Una comparación 2 semanas después de la banda aórtica entre las subcepas de ratón C57BL / 6N y C57BL / 6J mostró disfunción cardíaca grave y aumento asociado de la mortalidad en ratones C57BL / 6N. Por lo tanto, estos son más adecuados para los modelos de insuficiencia cardíaca12. Los ratones machos y hembras de doce semanas de edad tienen un tamaño óptimo para la exposición de la aorta y la colocación de la junta tórica con instrumentos especiales.
Protocol
Representative Results
Discussion
La banda aórtica basada en hilo / sutura se ha utilizado durante muchos años para inducir hipertrofia cardíaca por sobrecarga de presión en ratones. Es un método establecido para investigar los mecanismos patológicos de la remodelación cardíaca y la progresión de la enfermedad in vivo. Las limitaciones son la varianza relativamente alta en el grado de estenosis y, en consecuencia, la remodelación. La técnica ORAB recientemente introducida descrita por primera vez por Melleby et al.1…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) a L.L., N.F., y O.J.M. (IVOLADMT-HF; FKZ 01KC2006A).
Materials
| 1 x long Fixators, 6 cm | 18200-01 | ||
| 2 x Blunt Retractors, 5 mm wide | 18200-11 | ||
| 2 x Short Fixators, 3 cm | 18200-02 | ||
| 2 x fine tip 45° angled forceps | FST (fine sience tools) | 11160-10 | |
| 3 x Blunt Retractors, 2.5 mm wide | 18200-10 | ||
| 3 x Retractor Wires | 18200-05 | ||
| 4-0 absorbable suture (Vicryl) | ETHICON | SABBKLT0 | Used to suture skin |
| 6-0 suture (Prolene), needle size:13 mm | ETHICON | JDP879 | Used to suture chest muscle |
| 8-0 suture (Prolene), needle size: 6.5 mm | ETHICON | RHBECH | Used to fast the Ring |
| Anesthetizing Box, Small | Havard apparatus | 50-0108 | |
| C57BL/6N mice | Charles River | ||
| Fluosorber Activated Charcoal Filter Canister | Havard apparatus | 34-0415 | Used to induce and maintain anesthesia |
| Handmade laryngsopcope | Intubationshelp | ||
| Harvard Apparatus Anesthetic Vaporizer | Havard apparatus | Used to induce and maintain anesthesia | |
| Heating pad + rectal probe (LSI Letica Scientific Instruments:Temperature control unit HB 101/2 ) | Panlab/ Havard apparatus | Used to control and maintain body temperature | |
| i.v. cannula blue 22-gauge (Vasofix Braunüle 0.9 x 25 mm) | B/Braunsharing Expertise | 4268091B | intubation |
| isofluran | Baxter | Anesthesia | |
| Kodan (betadine solution) | Schülke | 20003960-A | Desinfection |
| ligation aid | FST (fine sience tools) | 18062-12 | Used to perform liagtion with O-ring |
| Microscope Lighting: Schott VisiLED Set MC1500/S80-55 (+ controller) | SCHOTT | Ligth | |
| Microscope camera (Leica IC80 HD) | Leica | Used for visualiation operating field | |
| MiniVac Complete Anesthesia Systems for small rodents | Havard apparatus | 75-0233 | Used to induce and maintain anesthesia |
| Mouse Ventilator MiniVent Type 845 | Havard Apparatus | 73-0044 | Used to ventilation during surgery |
| Needle holder | FST (fine sience tools) | TE-10804 | |
| O-ring, non-slip rubber (0.0018 mm x 0.020 mm) | Apple Rubber Products | Liagtion of the aortic arch | |
| Scissors | FST (fine sience tools) | 14040-09 | Used to cut the skin and threads |
| Small Animal Retraction System (Kit for Animals up to 200 g) | FST (fine sience tools) | 18200-20 | |
| Small Base Plate, 20 x 30 cm | 18200-03 | ||
| Table intgerated with heating pad + rectal probe + ECG and transducer tripod | FujiFilm Visual Sonics Imaging System | Echocardiography | |
| Temgesic (Buprenorphin) | Indivior UK Limited | 997.00.00 | Pain pre-medication |
| three-way stop cock (blue) | |||
| Tramal (Tamadol) | Grünental | Pain post-medication | |
| transducer probe MS400 (Visual Sonics) | FujiFilm Visual Sonics Imaging System | Echocardiography | |
| Ultrasound system with cardioligy package | FujiFilm Visual Sonics Imaging System | Echocardiography | |
| Vannas Spring Scissors – 2.5 mm Cutting Edge | FST (fine sience tools) | 15000-08 | Used to cut intercostal chest muscle |
| vet ointment | Bepanten | Used to prevent eyes from drying out |
Referências
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