In vitro Methode om op geslacht gebaseerde verschillen in conjunctivale bekercellen te bestuderen
Summary
Fenolroodvrij/foetaal runderserumvrij medium is een betere optie dan geavanceerde RPMI om exogene hormonen te elimineren zonder de normale functie van conjunctivale bekercellen te veranderen bij de studie van op geslacht gebaseerde verschillen.
Abstract
Droge ogen is een multifactoriële ziekte die de gezondheid van het oogoppervlak aantast, met een aanzienlijk hogere prevalentie bij vrouwen. Verstoring van het gelvormende mucine dat wordt uitgescheiden door conjunctivale bekercellen (CGC’s) op het oogoppervlak draagt bij aan meerdere ziekten van het oogoppervlak. De eliminatie van exogene geslachtshormonen is essentieel om consistente resultaten te verkrijgen tijdens in vitro onderzoek naar seksegerelateerde verschillen in CGC’s. Dit artikel beschrijft een methode om de aanwezigheid van exogene hormonen te minimaliseren in de studie van op geslacht gebaseerde verschillen in CGC’s met behoud van hun fysiologische functie. CGC’s van postmortale menselijke donoren van beide geslachten werden gekweekt uit stukjes van het bindvlies in RPMI-medium met 10% foetaal runderserum (FBS) (aangeduid als het volledige medium) tot samenvloeiing. Bijna 48 uur voor het begin van de experimenten werden CGC’s overgebracht naar RPMI-medium zonder fenolrood of FBS, maar met 1% BSA (aangeduid als fenolroodvrij medium). De normale cellulaire functie werd bestudeerd door de toename van intracellulaire [Ca 2+] ([Ca 2+]i) na carbachol (Cch, 1 x 10-4 M) stimulatie te meten met behulp van fura 2/acetoxymethyl (AM) microscopie. Het resultaat toont aan dat CGC’s na 48 uur hun normale functie in de fenolroodvrije media behielden. Er werd geen significant verschil in [Ca2+]i-respons waargenomen tussen fenolroodvrij RPMI-medium en volledig medium bij Cch-stimulatie. Daarom raden we aan om het fenolrode vrije RPMI-medium met 1% BSA te gebruiken om exogene hormonen te elimineren zonder de normale functie van CGC’s te veranderen bij de studie van op geslacht gebaseerde verschillen.
Introduction
Verschillen op basis van geslacht beïnvloeden meerdere processen van het oogoppervlak 1,2,3. De klinische manifestatie van deze op geslacht gebaseerde verschillen is het verschil in de prevalentie van veel aandoeningen van het oogoppervlak tussen mannen en vrouwen, zoals droge ogen en conjunctivitis 4,5,6. Er zijn aanwijzingen dat op geslacht gebaseerde verschillen voortkomen uit meerdere biologische niveaus, waaronder de verschillende profielen van genen op X- en Y-chromosomen7 en de effecten van hormonen8. Het bestuderen van de moleculaire basis van op geslacht gebaseerde verschillen kan een beter begrip van ziekte opleveren en uiteindelijk gepersonaliseerde geneeskunde verbeteren.
Het oogoppervlak bestaat uit de bovenliggende traanfilm, het hoornvlies en het bindvlies. Op geslacht gebaseerde verschillen worden waargenomen in meerdere componenten van het oogoppervlak, waaronder de traanfilm 9,10, hoornvlies 11, de traanklier 12,13 en klieren van Meibom die ook tranen afscheiden 12. Talrijke mechanistische studies hebben het effect van geslachtshormonen op het hoornvlies en de bijbehorende componenten onderzocht14,15; Er is echter weinig bekend over de op geslacht gebaseerde verschillen in het bindvlies en zijn bekercellen. Het bindvlies is een slijmvlies dat de sclera en het binnenoppervlak van het ooglid bedekt. Het epitheel van het bindvlies bestaat uit niet-keratiniserende, meerlagige, gelaagde plaveiselcellen16.
Onder de gestratificeerde plaveiselcellen van het bindvlies bevinden zich bekercellen (CGC’s) afgewisseld op het apicale oppervlak van het epitheel. Deze bekercellen worden gekenmerkt door het grote aantal secretoire korrels dat zich aan de apicale poolbevindt 17. CGC’s synthetiseren en scheiden het gelvormende mucine MUC5AC af om het oogoppervlak te hydrateren en te smeren tijdens het knipperen17. De mucinesecretie wordt strak gereguleerd door het intracellulaire [Ca 2+] ([Ca2+]i) en de activering van het Ras-afhankelijke extracellulaire signaalgereguleerde kinase (ERK1/2)18. Het onvermogen om mucine af te scheiden resulteert in uitdroging van het oogoppervlak en gevolgen van pathologische afwijkingen. Op een ontstoken oogoppervlak leidt uitgebreide mucinesecretie gestimuleerd door ontstekingsmediatoren echter tot een perceptie van plakkerigheid en jeuk van het oog19. Deze aandoeningen met verstoorde mucinesecretie zullen uiteindelijk leiden tot verslechtering van het oogoppervlak.
De rol van bekercellen als de belangrijkste bron van oculair mucine wordt al lang erkend20, maar de op geslacht gebaseerde verschillen in mucineregulatie in zowel fysiologische als pathologische toestanden blijven onontdekt. Een in vitro systeem zou nuttig zijn om de functie van bekercellen te controleren zonder het hormonale effect of met een nauwkeurig gecontroleerd niveau van geslachtshormonen. Hoewel er een conjunctivale epitheelcellijn is ontwikkeld21, is er geen bekercellijn met functionele mucinesecretie beschikbaar. Daarom hebben we onze ontwikkelde primaire menselijke CGC-cultuur aangepast om een methode vast te stellen om het op geslacht gebaseerde verschil in vitro16 te analyseren en het als volgt te presenteren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het onderzoeken van de op geslacht gebaseerde verschillen in oogweefsel helpt bij het begrijpen van de processen van ziekten, met name droge ogen en allergische conjunctivitis, die onevenredig veel invloed hebben op één geslacht 4,5,6. Hoewel voor deze onderzoeken diermodellen kunnen worden gebruikt, zijn gegevens die rechtstreeks uit menselijk weefsel zijn verkregen essentieel vanwege de grootste gelijkenis met de menselijke …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het werk wordt gefinancierd door de National Eye Institute Grant EY019470 (DAD).
Materials
| 0.05% trypsin with 1x EDTA | Gibco (Grand Island, NY) | 25300-054 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid | Fisher Bioreagent (Pittsburgh, PA) | BP310-500 | |
| Advanced RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 12633020 | |
| carbachol | Cayman Chemical (Ann Arbor, MI) | 144.86 | |
| Fetal Bovin Serum | R&D (Minneapolis, MN) | S11150H | |
| Fura-2- acetoxymethyl ester | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | F1221 | |
| Human conjunctival tissue | Eversight Eye Bank (Ann Arbor, MI) | N/A | |
| inorganic salt for KRB buffer | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | Any brand will work | |
| L-glutamine | Lonza Group (Basel, Switzerland) | 17-605F | |
| non-essential amino acids | Gibco (Grand Island, NY) | 11140-050 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco (Grand Island, NY) | 15140-122 | |
| phenol red-free RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 11835055 | |
| Pluronic acid F127 | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | P2443-250G | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco (Grand Island, NY) | 21875034 | |
| scalpel | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 12460451 | Any sterile surgical scalpel can work |
| sodium pyruvate | Gibco (Grand Island, NY) | 11360-070 | |
| sulfinpyrazone | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | S9509-5G |
Referências
- Gao, Y., et al. Female-specific downregulation of tissue polymorphonuclear neutrophils drives impaired regulatory T cell and amplified effector T cell responses in autoimmune dry eye disease. Journal of Immunology. 195, 3086-3099 (2015).
- Wang, S. B., et al. Estrogen negatively regulates epithelial wound healing and protective lipid mediator circuits in the cornea. FASEB Journal. 26, 1506-1516 (2012).
- Sullivan, D. A., Block, L., Pena, J. D. Influence of androgens and pituitary hormones on the structural profile and secretory activity of the lacrimal gland. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 74, 421-435 (1996).
- Schaumberg, D. A., Dana, R., Buring, J. E., Sullivan, D. A. Prevalence of dry eye disease among US men: estimates from the Physicians’ Health Studies. Archives of Ophthalmology. 127, 763-768 (2009).
- Tellefsen Nøland, S., et al. Sex and age differences in symptoms and signs of dry eye disease in a Norwegian cohort of patients. The Ocular Surface. 19, 68-73 (2021).
- Sullivan, D. A., et al. TFOS DEWS II Sex, gender, and hormones report. The Ocular Surface. 15, 284-333 (2017).
- Meester, I., et al. SeXY chromosomes and the immune system: reflections after a comparative study. Biology of Sex Differences. 11, 3 (2020).
- Yang, J. -. H., et al. Hormone replacement therapy reverses the decrease in natural killer cytotoxicity but does not reverse the decreases in the T-cell subpopulation or interferon-gamma production in postmenopausal women. Fertility and Sterility. 74, 261-267 (2000).
- Orucoglu, F., Akman, M., Onal, S. Analysis of age, refractive error and gender related changes of the cornea and the anterior segment of the eye with Scheimpflug imaging. Contact Lens & Anterior Eye. 38, 345-350 (2015).
- Strobbe, E., Cellini, M., Barbaresi, U., Campos, E. C. Influence of age and gender on corneal biomechanical properties in a healthy Italian population. Cornea. 33, 968-972 (2014).
- Sullivan, D. A., Jensen, R. V., Suzuki, T., Richards, S. M. Do sex steroids exert sex-specific and/or opposite effects on gene expression in lacrimal and meibomian glands. Molecular Vision. 15, 1553-1572 (2009).
- Bukhari, A. A., Basheer, N. A., Joharjy, H. I. Age, gender, and interracial variability of normal lacrimal gland volume using MRI. Ophthalmic Plastic and Reconstructive Surgery. 30, 388-391 (2014).
- Sullivan, B. D., Evans, J. E., Dana, M. R., Sullivan, D. A. Influence of aging on the polar and neutral lipid profiles in human meibomian gland secretions. Archives of Ophthalmology. 124, 1286-1292 (2006).
- Ebeigbe, J. A., Ebeigbe, P. N. The influence of sex hormone levels on tear production in postmenopausal Nigerian women. African Journal of Medicine and Medical Sciences. 43, 205-211 (2014).
- Suzuki, T., et al. Estrogen’s and progesterone’s impact on gene expression in the mouse lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47, 158-168 (2006).
- Shatos, M. A., et al. Isolation and characterization of cultured human conjunctival goblet cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44, 2477-2486 (2003).
- Huang, A. J., Tseng, S. C., Kenyon, K. R. Morphogenesis of rat conjunctival goblet cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 29, 969-975 (1988).
- Li, D., et al. Resolvin D1 and aspirin-triggered resolvin D1 regulate histamine-stimulated conjunctival goblet cell secretion. Mucosal Immunology. 6, 1119-1130 (2013).
- Dartt, D. A., Masli, S. Conjunctival epithelial and goblet cell function in chronic inflammation and ocular allergic inflammation. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 14, 464-470 (2014).
- Mantelli, F., Argüeso, P. Functions of ocular surface mucins in health and disease. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 8, 477-483 (2008).
- García-Posadas, L., et al. Characterization and functional performance of a commercial human conjunctival epithelial cell line. Experimental Eye Research. 223, 109220 (2022).
- Shatos, M. A., et al. Isolation, characterization, and propagation of rat conjunctival goblet cells in vitro. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 42, 1455-1464 (2001).
- Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. Estrogenic activity of phenol red. Molecular and Cellular Endocrinology. 57, 169-178 (1988).
- Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 2496-2500 (1986).
- García-Posadas, L., et al. Interaction of IFN-γ with cholinergic agonists to modulate rat and human goblet cell function. Mucosal Immunology. 9, 206-217 (2016).
- Li, D., Jiao, J., Shatos, M. A., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Effect of VIP on intracellular [Ca2 ], extracellular regulated kinase 1/2, and secretion in cultured rat conjunctival goblet cells. Investigative Opthalmology & Visual Science. 54, 2872-2884 (2013).
- Contrò, V., et al. Sex steroid hormone receptors, their ligands, and nuclear and non-nuclear pathways. AIMS Molecular Science. 2, 294-310 (2015).
- Valley, C. C., Solodin, N. M., Powers, G. L., Ellison, S. J., Alarid, E. T. Temporal variation in estrogen receptor-alpha protein turnover in the presence of estrogen. Journal of Molecular Endocrinology. 40, 23-34 (2008).
- Campen, C. A., Gorski, J. Anomalous behavior of protein synthesis inhibitors on the turnover of the estrogen receptor as measured by density labeling. Endocrinology. 119, 1454-1461 (1986).
- Yang, M., et al. Sex-based differences in conjunctival goblet cell responses to pro-inflammatory and pro-resolving mediators. Scientific Reports. 12, 16305 (2022).
