अंतःपात्र नेत्रश्लेष्मला गोब्लेट कोशिकाओं में सेक्स-आधारित अंतर का अध्ययन करने की विधि
Summary
भ्रूण गोजातीय सीरम-मुक्त माध्यम सेक्स-आधारित मतभेदों के अध्ययन में नेत्रश्लेष्मला गोब्लेट कोशिकाओं के सामान्य कार्य को बदले बिना बहिर्जात हार्मोन को खत्म करने के लिए उन्नत आरपीएमआई की तुलना में एक बेहतर विकल्प है।
Abstract
सूखी आंख एक बहु-कारक बीमारी है जो ओकुलर सतह स्वास्थ्य को प्रभावित करती है, जिसमें महिलाओं में गहराई से उच्च प्रसार होता है। नेत्र संबंधी सतह पर नेत्रश्लेष्मला गोब्लेट कोशिकाओं (सीजीसी) द्वारा स्रावित जेल बनाने वाले म्यूसिन का विघटन कई ओकुलर सतह रोगों में योगदान देता है। सीजीसी में सेक्स-आधारित मतभेदों के इन विट्रो अध्ययन के दौरान लगातार परिणाम प्राप्त करने के लिए बहिर्जात सेक्स हार्मोन का उन्मूलन आवश्यक है। यह पेपर सीजीसी में उनके शारीरिक कार्य को बनाए रखते हुए सेक्स-आधारित मतभेदों के अध्ययन में बहिर्जात हार्मोन की उपस्थिति को कम करने की एक विधि का वर्णन करता है। दोनों लिंगों के पोस्टमॉर्टम मानव दाताओं से सीजीसी को आरपीएमआई माध्यम में नेत्रश्लेष्मला के टुकड़ों से 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) (पूर्ण माध्यम के रूप में संदर्भित) के साथ संवर्धित किया गया था। प्रयोगों की शुरुआत से लगभग 48 घंटे पहले, सीजीसी को फिनोल लाल या एफबीएस के बिना आरपीएमआई माध्यम में स्थानांतरित कर दिया गया था, लेकिन 1% बीएसए (फिनोल-लाल-मुक्त माध्यम के रूप में संदर्भित) के साथ। सामान्य सेलुलर फ़ंक्शन का अध्ययन फुरा 2/एसिटोक्सीमिथाइल (एएम) माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके कार्बाकोल (सीसीएच, 1 x 10-4 एम) उत्तेजना के बाद इंट्रासेल्युलर [सीए 2+] ([सीए2+]आई) में वृद्धि को मापकर किया गया था। परिणाम से पता चलता है कि सीजीसी ने 48 घंटे के बाद फिनोल-लाल-मुक्त मीडिया में सामान्य कार्य बनाए रखा। [सीए2 +] आई प्रतिक्रिया में कोई महत्वपूर्ण अंतर फिनोल लाल-मुक्त आरपीएमआई माध्यम और सीसीएच उत्तेजना पर पूर्ण माध्यम के बीच नहीं देखा गया था। इसलिए, हम सेक्स-आधारित मतभेदों के अध्ययन में सीजीसी के सामान्य कार्य को बदलने के बिना बहिर्जात हार्मोन को खत्म करने के लिए 1% बीएसए के साथ फिनोल-लाल मुक्त आरपीएमआई माध्यम का उपयोग करने की सलाह देते हैं।
Introduction
सेक्स-आधारित मतभेद ओकुलर सतह 1,2,3 की कई प्रक्रियाओं को प्रभावित करते हैं। इन सेक्स-आधारित मतभेदों की नैदानिक अभिव्यक्ति पुरुषों और महिलाओं के बीच कई ओकुलर सतह रोगों के प्रसार में अंतर है, जैसे कि सूखी आंख और नेत्रश्लेष्मलाशोथ 4,5,6। साक्ष्य बताते हैं कि सेक्स-आधारित अंतर कई जैविक स्तरों से उत्पन्न होते हैं, जिसमें एक्स और वाई क्रोमोसोम7 पर जीन के विभिन्न प्रोफाइल और हार्मोन8 के प्रभाव शामिल हैं। सेक्स-आधारित मतभेदों के आणविक आधार का अध्ययन बीमारी की बेहतर समझ प्रदान कर सकता है और अंततः, व्यक्तिगत चिकित्सा में सुधार कर सकता है।
ओकुलर सतह में आंसू फिल्म, कॉर्निया और नेत्रश्लेष्मला शामिल हैं। ओकुलर सतह के कई घटकों में सेक्स-आधारित अंतर देखे जाते हैं, जिनमें आंसू फिल्म 9,10, कॉर्निया 11, लैक्रिमल ग्रंथि 12,13, और मेइबोमियन ग्रंथियां शामिल हैं जो आँसू 12 का स्राव भी करती हैं। कई यांत्रिक अध्ययनों ने कॉर्निया और इसके संबंधित घटकों पर सेक्स हार्मोन के प्रभाव की जांच की है14,15; हालांकि, नेत्रश्लेष्मला और इसकी गोब्लेट कोशिकाओं में सेक्स-आधारित अंतर के बारे में बहुत कम जानकारी है। नेत्रश्लेष्मला एक श्लेष्म झिल्ली है जो श्वेतपटल और पलक की आंतरिक सतह को कवर करती है। नेत्रश्लेष्मला के उपकला में नॉनकेराटिनाइजिंग, बहु-स्तरित, स्तरीकृत स्क्वैमस कोशिकाएंशामिल हैं।
नेत्रश्लेष्मला की स्तरीकृत स्क्वैमस कोशिकाओं में, एपिथेलियम की एपिकल सतह पर फैले गोब्लेट कोशिकाएं (सीजीसी) होती हैं। इन गोब्लेट कोशिकाओं को एपिकल पोल17 पर स्थित स्रावी कणिकाओं की बड़ी संख्या की विशेषता है। सीजीसी ओकुलर सतह को मॉइस्चराइज करने औरपलक झपकने के दौरान इसे चिकनाई देने के लिए जेल बनाने वाले म्यूसिन एमयूसी 5एसी को संश्लेषित और स्रावित करते हैं। म्यूसिन स्राव को इंट्रासेल्युलर [सीए 2+] ([सीए2+]आई) और रास-निर्भर बाह्य संकेत-विनियमित किनेज (ईआरके 1/2)18 के सक्रियण द्वारा कसकर नियंत्रित किया जाता है। श्लेष्म को स्रावित करने में असमर्थता के परिणामस्वरूप ओकुलर सतह का सूखापन और रोग संबंधी असामान्यताओं की अगली कड़ी होती है। एक सूजन ओकुलर सतह पर, हालांकि, भड़काऊ मध्यस्थों द्वारा उत्तेजित व्यापक श्लेष्म स्राव आंख की चिपचिपाहट और खुजली की धारणा की ओर जाताहै। परेशान श्लेष्म स्राव के साथ ये स्थितियां अंततः ओकुलर सतह की गिरावट का कारण बनेंगी।
ओकुलर म्यूसिन के प्रमुख स्रोत के रूप में गोब्लेट कोशिकाओं की भूमिका को लंबे समयसे मान्यता दी गई है, हालांकि, शारीरिक और रोग संबंधी दोनों राज्यों में म्यूसिन विनियमन में सेक्स-आधारित अंतर अज्ञात हैं। हार्मोनल प्रभाव के बिना या सेक्स हार्मोन के ठीक से नियंत्रित स्तर के साथ गोब्लेट कोशिकाओं के कार्य की निगरानी के लिए एक इन विट्रो सिस्टम उपयोगी होगा। भले ही एक नेत्रश्लेष्मला उपकला कोशिका लाइन21 विकसित हुई है, लेकिन कार्यात्मक श्लेष्म स्राव के साथ कोई गोब्लेट सेल लाइन उपलब्ध नहीं है। इसलिए, हमने विट्रो16 में सेक्स-आधारित अंतर का विश्लेषण करने के लिए एक विधि स्थापित करने के लिए अपनी विकसित प्राथमिक मानव सीजीसी संस्कृति को संशोधित किया, और इसे नीचे प्रस्तुत किया।
Protocol
Representative Results
Discussion
ओकुलर ऊतकों में सेक्स-आधारित मतभेदों की जांच करने से बीमारियों की प्रक्रियाओं को समझने में मदद मिलती है, विशेष रूप से सूखी आंख और एलर्जी नेत्रश्लेष्मलाशोथ, जो एक लिंग 4,5,6 को अस…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
काम राष्ट्रीय नेत्र संस्थान अनुदान EY019470 (डीएडी) द्वारा वित्त पोषित है।
Materials
| 0.05% trypsin with 1x EDTA | Gibco (Grand Island, NY) | 25300-054 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid | Fisher Bioreagent (Pittsburgh, PA) | BP310-500 | |
| Advanced RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 12633020 | |
| carbachol | Cayman Chemical (Ann Arbor, MI) | 144.86 | |
| Fetal Bovin Serum | R&D (Minneapolis, MN) | S11150H | |
| Fura-2- acetoxymethyl ester | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | F1221 | |
| Human conjunctival tissue | Eversight Eye Bank (Ann Arbor, MI) | N/A | |
| inorganic salt for KRB buffer | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | Any brand will work | |
| L-glutamine | Lonza Group (Basel, Switzerland) | 17-605F | |
| non-essential amino acids | Gibco (Grand Island, NY) | 11140-050 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco (Grand Island, NY) | 15140-122 | |
| phenol red-free RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 11835055 | |
| Pluronic acid F127 | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | P2443-250G | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco (Grand Island, NY) | 21875034 | |
| scalpel | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 12460451 | Any sterile surgical scalpel can work |
| sodium pyruvate | Gibco (Grand Island, NY) | 11360-070 | |
| sulfinpyrazone | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | S9509-5G |
Referências
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