O meio livre de vermelho fenol/soro fetal bovino é uma opção melhor do que o RPMI avançado para eliminar hormônios exógenos sem alterar a função normal das células caliciformes da conjuntiva no estudo de diferenças baseadas no sexo.
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Artigo de método
In vitro Método para Estudo de Diferenças Sexuais em Células Caliciformes Conjuntivais
Neste artigo
Resumo
Resumo
O olho seco é uma doença multifatorial que afeta a saúde da superfície ocular, com prevalência profundamente maior em mulheres. A ruptura da mucina formadora de gel que é secretada pelas células caliciformes conjuntivais (CGCs) na superfície ocular contribui para múltiplas doenças da superfície ocular. A eliminação de hormônios sexuais exógenos é essencial para a obtenção de resultados consistentes durante o estudo in vitro de diferenças sexuais em CGCs. Este trabalho descreve um método para minimizar a presença de hormônios exógenos no estudo de diferenças baseadas no sexo em CGCs, mantendo sua função fisiológica. CGCs de doadores humanos post-mortem de ambos os sexos foram cultivados a partir de pedaços da conjuntiva em meio RPMI com 10% de soro fetal bovino (SFB) (referido como meio completo) até a confluência. Cerca de 48 h antes do início dos experimentos, as CGCs foram transferidas para o meio RPMI sem vermelho de fenol ou SFB, mas com BSA a 1% (referido como meio livre de vermelho fenol). A função celular normal foi estudada medindo-se o aumento da [Ca 2+] ([Ca 2+]i) intracelular após estimulação com carbacol (Cch, 1 x 10-4 M) usando microscopia de fura 2/acetoximetil (AM). O resultado mostra que os CGCs mantiveram função normal no meio livre de fenol após 48 h. Nenhuma diferença significativa na resposta [Ca2+]i foi observada entre o meio RPMI livre de fenol vermelho e o meio completo após estimulação com Cch. Portanto, recomendamos o uso do meio RPMI livre de vermelho fenol com BSA a 1% para eliminar hormônios exógenos sem alterar a função normal das CGCs no estudo de diferenças baseadas no sexo.
Introdução
Diferenças baseadas no sexo afetam múltiplos processos da superfície ocular 1,2,3. A manifestação clínica dessas diferenças baseadas no sexo é a diferença na prevalência de muitas doenças da superfície ocular entre homens e mulheres, como olho seco e conjuntivite4,5,6. Evidências sugerem que as diferenças baseadas no sexo surgem de múltiplos níveis biológicos, incluindo os diferentes perfis de genes nos cromossomos X e Y7 e os efeitos dos hormônios
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Protocolo
Todo tecido humano foi doado ao banco de olhos com consentimento prévio informado e autorização do doador para uso em pesquisas científicas. O uso do tecido conjuntival humano foi revisado pelo Massachusetts Eye and Ear Human Studies Committee e determinado como isento e não atendendo à definição de pesquisa com seres humanos.
1. Cultura primária de células caliciformes humanas
- Do banco de olhos, obtém-se tecido conjuntival humano16.
- Preparar o meio de cultura, meio de cultura RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB), 2 mM de glutamina, 2 mM de aminoácidos não ess....
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Resultados
Os CGCs humanos em cultura primária crescem até 80% de confluência em aproximadamente 14 dias. O tipo celular foi confirmado pela coloração por imunofluorescência com anticorpos contra os marcadores caliciformes CK7 e HPA-125 (Figura 1). Embora a remoção de FBS do meio possa eliminar os hormônios sexuais, a falta de FBS poderia potencialmente afetar a resposta celular. Para verificar o método de eliminação hormonal, um agonista colinérgico (carbachol, Cch 1 × 10-.......
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Discussão
A investigação das diferenças sexuais nos tecidos oculares ajuda a compreender os processos das doenças, especialmente o olho seco e a conjuntivite alérgica, que afetam desproporcionalmente um sexo 4,5,6. Embora modelos animais possam ser utilizados para esses estudos, dados obtidos diretamente do tecido humano são essenciais devido à maior similaridade com as células humanas in vivo. Os tecidos conjuntivais utilizados .......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse.
Agradecimentos
O trabalho é financiado pelo National Eye Institute Grant EY019470 (D.A.D).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,05% de tripsina com 1x EDTA | Gibco (Grand Island, NY) | 25300-054 | |
| 4- (2-hidroxietil) -1- ácido piperazineetanossulfônico | Fisher Bioreagent (Pittsburgh, PA) | BP310-500 | |
| Mídia RPMI avançada | Gibco (Grand Island, NY) | 12633020 | |
| carbacol | Cayman Chemical (Ann Arbor, MI) | 144,86 | |
| Soro Fetal Bovin | R& D (Minneapolis, MN) | S11150H | |
| Fura-2- éster acetoximetílico | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, EUA) | F1221 | |
| Tecido conjuntival humano | Eversight Eye Bank (Ann Arbor, MI) | N/A | |
| sal inorgânico para buffer KRB | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | Qualquer marca funcionará | |
| L-glutamina | Lonza Group (Basel, Suíça) | 17-605F | |
| aminoácidos não essenciais | Gibco (Grand Island, NY) | 11140-050 | |
| penicilina/estreptomicina | Gibco (Grand Island, NY) | 15140-122 | |
| fenol sem vermelho Mídia RPMI | Gibco (Grand Island, NY) | 11835055 | |
| Ácido plurônico F127 | MilliporeSigma (Burlington, MA, EUA) | P2443-250G | |
| RPMI-1640 meio de cultura | Gibco (Grand Island, NY) | 21875034 | |
| bisturi | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, EUA) | 12460451 | Qualquer bisturi cirúrgico estéril pode trabalhar |
| piruvato de sódio | Gibco (Grand Island, NY) | 11360-070 | |
| sulfinpirazona | MilliporeSigma (Burlington, MA, EUA) | S9509-5G |
Referências
- Gao, Y., et al. Female-specific downregulation of tissue polymorphonuclear neutrophils drives impaired regulatory T cell and amplified effector T cell responses in autoimmune dry eye disease. Journal of Immunology. 195, 3086-3099 (2015).
- Wang, S. B., et al.
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Reimpressões e permissões
