In vitro Metode for å studere kjønnsbaserte forskjeller i konjunktivale begerceller
Summary
Fenol rødfritt / føtalt bovint serumfritt medium er et bedre alternativ enn avansert RPMI for å eliminere eksogene hormoner uten å endre den normale funksjonen til konjunktivale begerceller i studiet av kjønnsbaserte forskjeller.
Abstract
Tørre øyne er en multifaktoriell sykdom som påvirker okulær overflatehelse, med en dypt høyere prevalens hos kvinner. Forstyrrelse av det geldannende slimet som utskilles av konjunktivale begerceller (CGC) på den okulære overflaten bidrar til flere okulære overflatesykdommer. Eliminering av eksogene kjønnshormoner er avgjørende for å oppnå konsistente resultater under in vitro-studier av kjønnsbaserte forskjeller i CGC. Denne artikkelen beskriver en metode for å minimere tilstedeværelsen av eksogene hormoner i studiet av kjønnsbaserte forskjeller i CGC samtidig som deres fysiologiske funksjon opprettholdes. CGC fra post mortem menneskelige donorer av begge kjønn ble dyrket fra biter av bindehinnen i RPMI-medium med 10% føtalt bovint serum (FBS) (referert til som komplett medium) til sammenløp. Nesten 48 timer før starten av forsøkene ble CGC overført til RPMI-medium uten fenolrødt eller FBS, men med 1% BSA (referert til som fenol-rødfritt medium). Den normale cellulære funksjonen ble studert ved å måle økningen i intracellulær [Ca 2+] ([Ca2+]i) etter stimulering av karbachol (Cch, 1 x 10-4 M) ved bruk av fura 2/acetoksymetyl (AM) mikroskopi. Resultatet viser at CGC opprettholdt normal funksjon i fenolfrie medier etter 48 timer. Det ble ikke observert noen signifikant forskjell i [Ca2+]i respons mellom fenol rødfritt RPMI medium og komplett medium ved Cch-stimulering. Derfor anbefaler vi å bruke det fenolrøde frie RPMI-mediet med 1% BSA for å eliminere eksogene hormoner uten å endre den normale funksjonen til CGC i studien av kjønnsbaserte forskjeller.
Introduction
Kjønnsbaserte forskjeller påvirker flere prosesser på den okulære overflaten 1,2,3. Den kliniske manifestasjonen av disse kjønnsbaserte forskjellene er forskjellen i forekomsten av mange okulære overflatesykdommer mellom menn og kvinner, som tørre øyne og konjunktivitt 4,5,6. Bevis tyder på at kjønnsbaserte forskjeller oppstår fra flere biologiske nivåer, inkludert de forskjellige profilene av gener på X- og Y-kromosomer7 og effekten av hormoner8. Å studere det molekylære grunnlaget for kjønnsbaserte forskjeller kan gi en bedre forståelse av sykdom og til slutt forbedre personlig medisin.
Den okulære overflaten består av den overliggende tårfilmen, hornhinnen og bindehinden. Kjønnsbaserte forskjeller observeres i flere komponenter i den okulære overflaten, inkludert tårefilmen 9,10, hornhinnen 11, lacrimalkjertelen 12,13 og meibomiske kjertler som også utskiller tårer 12. Tallrike mekanistiske studier har undersøkt effekten av kjønnshormoner på hornhinnen og tilhørende komponenter14,15; Imidlertid er lite kjent om de kjønnsbaserte forskjellene i bindehinnen og dens begerceller. Konjunktivene er en slimhinne som dekker scleraen og den indre overflaten av øyelokket. Epitelet i konjunktivene består av ikke-keratiniserende, flerlags, stratifiserte plateepitelceller16.
Blant de stratifiserte plateepitelcellene i konjunktivene er det bobleceller (CGC) spredt på epitelets apikale overflate. Disse boblecellene er preget av det store antallet sekretoriske granulater som ligger ved den apikale polen17. CGC syntetiserer og utskiller det geldannende slimet MUC5AC for å fukte den okulære overflaten og smøre den under blinking17. Mucinsekresjon reguleres tett av den intracellulære [Ca 2+] ([Ca2+]i) og aktiveringen av den Ras-avhengige ekstracellulære signalregulerte kinasen (ERK1/2)18. Manglende evne til å utskille mucin resulterer i tørrhet i den okulære overflaten og følgetilstander av patologiske abnormiteter. På en betent okulær overflate fører imidlertid omfattende slimutskillelse stimulert av inflammatoriske mediatorer til en oppfatning av klebrighet og kløe i øyet19. Disse forholdene med forstyrret mucinsekresjon vil til slutt føre til forringelse av den okulære overflaten.
Rollen til begerceller som den viktigste kilden til okulær mucin, har lenge vært anerkjent20, men de kjønnsbaserte forskjellene i mucinregulering i både fysiologiske og patologiske tilstander forblir uoppdaget. Et in vitro-system ville være nyttig for å overvåke funksjonen av bobleceller uten hormonell effekt eller med et nøyaktig kontrollert nivå av kjønnshormoner. Selv om en konjunktival epitelcellelinje har utviklet21, er det ingen begercellelinje med funksjonell slimutskillelse tilgjengelig. Derfor modifiserte vi vår utviklede primære menneskelige CGC-kultur for å etablere en metode for å analysere den kjønnsbaserte forskjellen in vitro16, og presentere den som nedenfor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Undersøkelse av kjønnsbaserte forskjeller i okulært vev bidrar til å forstå sykdomsprosessene, spesielt tørre øyne og allergisk konjunktivitt, som uforholdsmessig påvirker ett kjønn 4,5,6. Selv om dyremodeller kan brukes til disse studiene, er data hentet direkte fra humant vev avgjørende på grunn av den høyeste likheten med humane celler in vivo. Konjunktivvevene som brukes i den nåværende eksperimentelle…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbeidet er finansiert av National Eye Institute Grant EY019470 (DAD).
Materials
| 0.05% trypsin with 1x EDTA | Gibco (Grand Island, NY) | 25300-054 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid | Fisher Bioreagent (Pittsburgh, PA) | BP310-500 | |
| Advanced RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 12633020 | |
| carbachol | Cayman Chemical (Ann Arbor, MI) | 144.86 | |
| Fetal Bovin Serum | R&D (Minneapolis, MN) | S11150H | |
| Fura-2- acetoxymethyl ester | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | F1221 | |
| Human conjunctival tissue | Eversight Eye Bank (Ann Arbor, MI) | N/A | |
| inorganic salt for KRB buffer | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | Any brand will work | |
| L-glutamine | Lonza Group (Basel, Switzerland) | 17-605F | |
| non-essential amino acids | Gibco (Grand Island, NY) | 11140-050 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco (Grand Island, NY) | 15140-122 | |
| phenol red-free RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 11835055 | |
| Pluronic acid F127 | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | P2443-250G | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco (Grand Island, NY) | 21875034 | |
| scalpel | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 12460451 | Any sterile surgical scalpel can work |
| sodium pyruvate | Gibco (Grand Island, NY) | 11360-070 | |
| sulfinpyrazone | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | S9509-5G |
Referências
- Gao, Y., et al. Female-specific downregulation of tissue polymorphonuclear neutrophils drives impaired regulatory T cell and amplified effector T cell responses in autoimmune dry eye disease. Journal of Immunology. 195, 3086-3099 (2015).
- Wang, S. B., et al. Estrogen negatively regulates epithelial wound healing and protective lipid mediator circuits in the cornea. FASEB Journal. 26, 1506-1516 (2012).
- Sullivan, D. A., Block, L., Pena, J. D. Influence of androgens and pituitary hormones on the structural profile and secretory activity of the lacrimal gland. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 74, 421-435 (1996).
- Schaumberg, D. A., Dana, R., Buring, J. E., Sullivan, D. A. Prevalence of dry eye disease among US men: estimates from the Physicians’ Health Studies. Archives of Ophthalmology. 127, 763-768 (2009).
- Tellefsen Nøland, S., et al. Sex and age differences in symptoms and signs of dry eye disease in a Norwegian cohort of patients. The Ocular Surface. 19, 68-73 (2021).
- Sullivan, D. A., et al. TFOS DEWS II Sex, gender, and hormones report. The Ocular Surface. 15, 284-333 (2017).
- Meester, I., et al. SeXY chromosomes and the immune system: reflections after a comparative study. Biology of Sex Differences. 11, 3 (2020).
- Yang, J. -. H., et al. Hormone replacement therapy reverses the decrease in natural killer cytotoxicity but does not reverse the decreases in the T-cell subpopulation or interferon-gamma production in postmenopausal women. Fertility and Sterility. 74, 261-267 (2000).
- Orucoglu, F., Akman, M., Onal, S. Analysis of age, refractive error and gender related changes of the cornea and the anterior segment of the eye with Scheimpflug imaging. Contact Lens & Anterior Eye. 38, 345-350 (2015).
- Strobbe, E., Cellini, M., Barbaresi, U., Campos, E. C. Influence of age and gender on corneal biomechanical properties in a healthy Italian population. Cornea. 33, 968-972 (2014).
- Sullivan, D. A., Jensen, R. V., Suzuki, T., Richards, S. M. Do sex steroids exert sex-specific and/or opposite effects on gene expression in lacrimal and meibomian glands. Molecular Vision. 15, 1553-1572 (2009).
- Bukhari, A. A., Basheer, N. A., Joharjy, H. I. Age, gender, and interracial variability of normal lacrimal gland volume using MRI. Ophthalmic Plastic and Reconstructive Surgery. 30, 388-391 (2014).
- Sullivan, B. D., Evans, J. E., Dana, M. R., Sullivan, D. A. Influence of aging on the polar and neutral lipid profiles in human meibomian gland secretions. Archives of Ophthalmology. 124, 1286-1292 (2006).
- Ebeigbe, J. A., Ebeigbe, P. N. The influence of sex hormone levels on tear production in postmenopausal Nigerian women. African Journal of Medicine and Medical Sciences. 43, 205-211 (2014).
- Suzuki, T., et al. Estrogen’s and progesterone’s impact on gene expression in the mouse lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47, 158-168 (2006).
- Shatos, M. A., et al. Isolation and characterization of cultured human conjunctival goblet cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44, 2477-2486 (2003).
- Huang, A. J., Tseng, S. C., Kenyon, K. R. Morphogenesis of rat conjunctival goblet cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 29, 969-975 (1988).
- Li, D., et al. Resolvin D1 and aspirin-triggered resolvin D1 regulate histamine-stimulated conjunctival goblet cell secretion. Mucosal Immunology. 6, 1119-1130 (2013).
- Dartt, D. A., Masli, S. Conjunctival epithelial and goblet cell function in chronic inflammation and ocular allergic inflammation. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 14, 464-470 (2014).
- Mantelli, F., Argüeso, P. Functions of ocular surface mucins in health and disease. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 8, 477-483 (2008).
- García-Posadas, L., et al. Characterization and functional performance of a commercial human conjunctival epithelial cell line. Experimental Eye Research. 223, 109220 (2022).
- Shatos, M. A., et al. Isolation, characterization, and propagation of rat conjunctival goblet cells in vitro. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 42, 1455-1464 (2001).
- Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. Estrogenic activity of phenol red. Molecular and Cellular Endocrinology. 57, 169-178 (1988).
- Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 2496-2500 (1986).
- García-Posadas, L., et al. Interaction of IFN-γ with cholinergic agonists to modulate rat and human goblet cell function. Mucosal Immunology. 9, 206-217 (2016).
- Li, D., Jiao, J., Shatos, M. A., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Effect of VIP on intracellular [Ca2 ], extracellular regulated kinase 1/2, and secretion in cultured rat conjunctival goblet cells. Investigative Opthalmology & Visual Science. 54, 2872-2884 (2013).
- Contrò, V., et al. Sex steroid hormone receptors, their ligands, and nuclear and non-nuclear pathways. AIMS Molecular Science. 2, 294-310 (2015).
- Valley, C. C., Solodin, N. M., Powers, G. L., Ellison, S. J., Alarid, E. T. Temporal variation in estrogen receptor-alpha protein turnover in the presence of estrogen. Journal of Molecular Endocrinology. 40, 23-34 (2008).
- Campen, C. A., Gorski, J. Anomalous behavior of protein synthesis inhibitors on the turnover of the estrogen receptor as measured by density labeling. Endocrinology. 119, 1454-1461 (1986).
- Yang, M., et al. Sex-based differences in conjunctival goblet cell responses to pro-inflammatory and pro-resolving mediators. Scientific Reports. 12, 16305 (2022).
