Среда, не содержащая фенола красного/фетального бычьего сыворотки, является лучшим вариантом, чем продвинутый RPMI, для элиминации экзогенных гормонов без изменения нормальной функции бокаловидных клеток конъюнктивы при изучении половых различий.
Синдром сухого глаза является многофакторным заболеванием, влияющим на здоровье глазной поверхности, с гораздо более высокой распространенностью среди женщин. Разрушение гелеобразующего муцина, который секретируется бокаловидными клетками конъюнктивы (CGC) на поверхности глаза, способствует возникновению множественных заболеваний глазной поверхности. Элиминация экзогенных половых гормонов имеет важное значение для получения устойчивых результатов при исследовании in vitro половых различий в CGC. В данной работе описан метод минимизации присутствия экзогенных гормонов при изучении половых различий в CGC при сохранении их физиологической функции. CGC от посмертных доноров обоих полов культивировали из кусочков конъюнктивы в среде RPMI с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) (называемой полной средой) до слияния. Примерно за 48 ч до начала экспериментов CGC переводили в среду RPMI без фенолового красного или FBS, но с 1% BSA (так называемая среда без фенол-красного). Нормальную клеточную функцию изучали путем измерения увеличения внутриклеточного [Ca2+] ([Ca2+]i) после стимуляции карбахолом (Cch, 1 x 10-4 M) с помощью фура-2/ацетоксиметиловой (AM) микроскопии. Результат показывает, что CGC сохраняли нормальную функцию в средах, не содержащих фенол-красного, через 48 ч. Не было выявлено существенной разницы в ответе [Ca2+]i между средой RPMI, не содержащей фенолового красного, и полной средой при стимуляции Cch. Поэтому мы рекомендуем использовать свободную от фенола красную среду RPMI с 1% БСА для элиминации экзогенных гормонов без изменения нормальной функции CGC при исследовании половых различий.
Половые различия влияют на множественные процессы глазной поверхности 1,2,3. Клиническим проявлением этих половых различий является разница в распространенности многих заболеваний глазной поверхности у мужчин и женщин, таких как сухость глаз и конъюнктивит 4,5,6. Фактические данные свидетельствуют о том, что половые различия возникают на нескольких биологических уровнях, включая различные профили генов на X- и Y-хромосомах7 и влияние гормонов8. Изучение молекулярных основ половых различий может обеспечить лучшее понимание болезней и, в конечном итоге, улучшить персонализированную медицину.
Глазная поверхность состоит из вышележащей слезной пленки, роговицы и конъюнктивы. Половые различия наблюдаются во многих компонентах глазной поверхности, включая слезную пленку 9,10, роговицу 11, слезную железу 12,13 и мейбомиевые железы, которые также выделяют слезы 12. В многочисленных механистических исследованиях изучалось влияние половых гормонов на роговицу и связанные с ней компоненты14,15; Тем не менее, мало что известно о половых различиях в конъюнктиве и ее бокаловидных клетках. Конъюнктива – это слизистая оболочка, которая покрывает склеру и внутреннюю поверхность века. Эпителий конъюнктивы состоит из неороговевающих, многослойных, слоистых плоскоклеточных клеток16.
Среди многослойных плоскоклеточных клеток конъюнктивы имеются бокаловидные клетки (CGC), вкрапленные на апикальной поверхности эпителия. Эти бокаловидные клетки характеризуются большим количеством секреторных гранул, расположенных на апикальном полюсе17. CGC синтезируют и секретируют гелеобразующий муцин MUC5AC для увлажнения глазной поверхности и смазывания ее во время моргания17. Секреция муцина жестко регулируется внутриклеточным [Ca2+] ([Ca2+]i) и активацией Ras-зависимой внеклеточной сигнально-регулируемой киназы (ERK1/2)18. Неспособность выделять муцин приводит к сухости глазной поверхности и последствиям патологических отклонений. Однако на воспаленной глазной поверхности обширная секреция муцина, стимулируемая медиаторами воспаления, приводит к восприятию липкости и зуда в глазах19. Эти состояния с нарушенной секрецией муцина в конечном итоге приведут к ухудшению состояния глазной поверхности.
Роль бокаловидных клеток как основного источника глазного муцина давно признана20, однако половые различия в регуляции муцина как при физиологических, так и при патологических состояниях остаются неоткрытыми. Система in vitro была бы полезна для мониторинга функции бокаловидных клеток без гормонального эффекта или с точно контролируемым уровнем половых гормонов. Несмотря на то, что сформировалась клеточная линия эпителия конъюнктивы 21, не существует бокаловиднойклеточной линии с функциональной секрецией муцина. Таким образом, мы модифицировали разработанную нами первичную культуру CGC человека, чтобы создать метод анализа половых различий in vitro16, и представили его следующим образом.
Изучение половых различий в тканях глаза помогает понять процессы заболеваний, особенно синдрома сухого глаза и аллергического конъюнктивита, которые непропорционально поражают один пол 4,5,6. Несмотря на то, что для этих исследований ?…
The authors have nothing to disclose.
Работа финансируется за счет гранта Национального института глаза EY019470 (D.A.D.).
0.05% trypsin with 1x EDTA | Gibco (Grand Island, NY) | 25300-054 | |
4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid | Fisher Bioreagent (Pittsburgh, PA) | BP310-500 | |
Advanced RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 12633020 | |
carbachol | Cayman Chemical (Ann Arbor, MI) | 144.86 | |
Fetal Bovin Serum | R&D (Minneapolis, MN) | S11150H | |
Fura-2- acetoxymethyl ester | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | F1221 | |
Human conjunctival tissue | Eversight Eye Bank (Ann Arbor, MI) | N/A | |
inorganic salt for KRB buffer | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | Any brand will work | |
L-glutamine | Lonza Group (Basel, Switzerland) | 17-605F | |
non-essential amino acids | Gibco (Grand Island, NY) | 11140-050 | |
penicillin/streptomycin | Gibco (Grand Island, NY) | 15140-122 | |
phenol red-free RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 11835055 | |
Pluronic acid F127 | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | P2443-250G | |
RPMI-1640 culture medium | Gibco (Grand Island, NY) | 21875034 | |
scalpel | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 12460451 | Any sterile surgical scalpel can work |
sodium pyruvate | Gibco (Grand Island, NY) | 11360-070 | |
sulfinpyrazone | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | S9509-5G |