In Vitro Метод изучения половых различий в бокаловидных клетках конъюнктивы
Summary
Среда, не содержащая фенола красного/фетального бычьего сыворотки, является лучшим вариантом, чем продвинутый RPMI, для элиминации экзогенных гормонов без изменения нормальной функции бокаловидных клеток конъюнктивы при изучении половых различий.
Abstract
Синдром сухого глаза является многофакторным заболеванием, влияющим на здоровье глазной поверхности, с гораздо более высокой распространенностью среди женщин. Разрушение гелеобразующего муцина, который секретируется бокаловидными клетками конъюнктивы (CGC) на поверхности глаза, способствует возникновению множественных заболеваний глазной поверхности. Элиминация экзогенных половых гормонов имеет важное значение для получения устойчивых результатов при исследовании in vitro половых различий в CGC. В данной работе описан метод минимизации присутствия экзогенных гормонов при изучении половых различий в CGC при сохранении их физиологической функции. CGC от посмертных доноров обоих полов культивировали из кусочков конъюнктивы в среде RPMI с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) (называемой полной средой) до слияния. Примерно за 48 ч до начала экспериментов CGC переводили в среду RPMI без фенолового красного или FBS, но с 1% BSA (так называемая среда без фенол-красного). Нормальную клеточную функцию изучали путем измерения увеличения внутриклеточного [Ca2+] ([Ca2+]i) после стимуляции карбахолом (Cch, 1 x 10-4 M) с помощью фура-2/ацетоксиметиловой (AM) микроскопии. Результат показывает, что CGC сохраняли нормальную функцию в средах, не содержащих фенол-красного, через 48 ч. Не было выявлено существенной разницы в ответе [Ca2+]i между средой RPMI, не содержащей фенолового красного, и полной средой при стимуляции Cch. Поэтому мы рекомендуем использовать свободную от фенола красную среду RPMI с 1% БСА для элиминации экзогенных гормонов без изменения нормальной функции CGC при исследовании половых различий.
Introduction
Половые различия влияют на множественные процессы глазной поверхности 1,2,3. Клиническим проявлением этих половых различий является разница в распространенности многих заболеваний глазной поверхности у мужчин и женщин, таких как сухость глаз и конъюнктивит 4,5,6. Фактические данные свидетельствуют о том, что половые различия возникают на нескольких биологических уровнях, включая различные профили генов на X- и Y-хромосомах7 и влияние гормонов8. Изучение молекулярных основ половых различий может обеспечить лучшее понимание болезней и, в конечном итоге, улучшить персонализированную медицину.
Глазная поверхность состоит из вышележащей слезной пленки, роговицы и конъюнктивы. Половые различия наблюдаются во многих компонентах глазной поверхности, включая слезную пленку 9,10, роговицу 11, слезную железу 12,13 и мейбомиевые железы, которые также выделяют слезы 12. В многочисленных механистических исследованиях изучалось влияние половых гормонов на роговицу и связанные с ней компоненты14,15; Тем не менее, мало что известно о половых различиях в конъюнктиве и ее бокаловидных клетках. Конъюнктива – это слизистая оболочка, которая покрывает склеру и внутреннюю поверхность века. Эпителий конъюнктивы состоит из неороговевающих, многослойных, слоистых плоскоклеточных клеток16.
Среди многослойных плоскоклеточных клеток конъюнктивы имеются бокаловидные клетки (CGC), вкрапленные на апикальной поверхности эпителия. Эти бокаловидные клетки характеризуются большим количеством секреторных гранул, расположенных на апикальном полюсе17. CGC синтезируют и секретируют гелеобразующий муцин MUC5AC для увлажнения глазной поверхности и смазывания ее во время моргания17. Секреция муцина жестко регулируется внутриклеточным [Ca2+] ([Ca2+]i) и активацией Ras-зависимой внеклеточной сигнально-регулируемой киназы (ERK1/2)18. Неспособность выделять муцин приводит к сухости глазной поверхности и последствиям патологических отклонений. Однако на воспаленной глазной поверхности обширная секреция муцина, стимулируемая медиаторами воспаления, приводит к восприятию липкости и зуда в глазах19. Эти состояния с нарушенной секрецией муцина в конечном итоге приведут к ухудшению состояния глазной поверхности.
Роль бокаловидных клеток как основного источника глазного муцина давно признана20, однако половые различия в регуляции муцина как при физиологических, так и при патологических состояниях остаются неоткрытыми. Система in vitro была бы полезна для мониторинга функции бокаловидных клеток без гормонального эффекта или с точно контролируемым уровнем половых гормонов. Несмотря на то, что сформировалась клеточная линия эпителия конъюнктивы 21, не существует бокаловиднойклеточной линии с функциональной секрецией муцина. Таким образом, мы модифицировали разработанную нами первичную культуру CGC человека, чтобы создать метод анализа половых различий in vitro16, и представили его следующим образом.
Protocol
Representative Results
Discussion
Изучение половых различий в тканях глаза помогает понять процессы заболеваний, особенно синдрома сухого глаза и аллергического конъюнктивита, которые непропорционально поражают один пол 4,5,6. Несмотря на то, что для этих исследований ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа финансируется за счет гранта Национального института глаза EY019470 (D.A.D.).
Materials
| 0.05% trypsin with 1x EDTA | Gibco (Grand Island, NY) | 25300-054 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid | Fisher Bioreagent (Pittsburgh, PA) | BP310-500 | |
| Advanced RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 12633020 | |
| carbachol | Cayman Chemical (Ann Arbor, MI) | 144.86 | |
| Fetal Bovin Serum | R&D (Minneapolis, MN) | S11150H | |
| Fura-2- acetoxymethyl ester | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | F1221 | |
| Human conjunctival tissue | Eversight Eye Bank (Ann Arbor, MI) | N/A | |
| inorganic salt for KRB buffer | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | Any brand will work | |
| L-glutamine | Lonza Group (Basel, Switzerland) | 17-605F | |
| non-essential amino acids | Gibco (Grand Island, NY) | 11140-050 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco (Grand Island, NY) | 15140-122 | |
| phenol red-free RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 11835055 | |
| Pluronic acid F127 | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | P2443-250G | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco (Grand Island, NY) | 21875034 | |
| scalpel | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 12460451 | Any sterile surgical scalpel can work |
| sodium pyruvate | Gibco (Grand Island, NY) | 11360-070 | |
| sulfinpyrazone | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | S9509-5G |
Referências
- Gao, Y., et al. Female-specific downregulation of tissue polymorphonuclear neutrophils drives impaired regulatory T cell and amplified effector T cell responses in autoimmune dry eye disease. Journal of Immunology. 195, 3086-3099 (2015).
- Wang, S. B., et al. Estrogen negatively regulates epithelial wound healing and protective lipid mediator circuits in the cornea. FASEB Journal. 26, 1506-1516 (2012).
- Sullivan, D. A., Block, L., Pena, J. D. Influence of androgens and pituitary hormones on the structural profile and secretory activity of the lacrimal gland. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 74, 421-435 (1996).
- Schaumberg, D. A., Dana, R., Buring, J. E., Sullivan, D. A. Prevalence of dry eye disease among US men: estimates from the Physicians’ Health Studies. Archives of Ophthalmology. 127, 763-768 (2009).
- Tellefsen Nøland, S., et al. Sex and age differences in symptoms and signs of dry eye disease in a Norwegian cohort of patients. The Ocular Surface. 19, 68-73 (2021).
- Sullivan, D. A., et al. TFOS DEWS II Sex, gender, and hormones report. The Ocular Surface. 15, 284-333 (2017).
- Meester, I., et al. SeXY chromosomes and the immune system: reflections after a comparative study. Biology of Sex Differences. 11, 3 (2020).
- Yang, J. -. H., et al. Hormone replacement therapy reverses the decrease in natural killer cytotoxicity but does not reverse the decreases in the T-cell subpopulation or interferon-gamma production in postmenopausal women. Fertility and Sterility. 74, 261-267 (2000).
- Orucoglu, F., Akman, M., Onal, S. Analysis of age, refractive error and gender related changes of the cornea and the anterior segment of the eye with Scheimpflug imaging. Contact Lens & Anterior Eye. 38, 345-350 (2015).
- Strobbe, E., Cellini, M., Barbaresi, U., Campos, E. C. Influence of age and gender on corneal biomechanical properties in a healthy Italian population. Cornea. 33, 968-972 (2014).
- Sullivan, D. A., Jensen, R. V., Suzuki, T., Richards, S. M. Do sex steroids exert sex-specific and/or opposite effects on gene expression in lacrimal and meibomian glands. Molecular Vision. 15, 1553-1572 (2009).
- Bukhari, A. A., Basheer, N. A., Joharjy, H. I. Age, gender, and interracial variability of normal lacrimal gland volume using MRI. Ophthalmic Plastic and Reconstructive Surgery. 30, 388-391 (2014).
- Sullivan, B. D., Evans, J. E., Dana, M. R., Sullivan, D. A. Influence of aging on the polar and neutral lipid profiles in human meibomian gland secretions. Archives of Ophthalmology. 124, 1286-1292 (2006).
- Ebeigbe, J. A., Ebeigbe, P. N. The influence of sex hormone levels on tear production in postmenopausal Nigerian women. African Journal of Medicine and Medical Sciences. 43, 205-211 (2014).
- Suzuki, T., et al. Estrogen’s and progesterone’s impact on gene expression in the mouse lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47, 158-168 (2006).
- Shatos, M. A., et al. Isolation and characterization of cultured human conjunctival goblet cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44, 2477-2486 (2003).
- Huang, A. J., Tseng, S. C., Kenyon, K. R. Morphogenesis of rat conjunctival goblet cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 29, 969-975 (1988).
- Li, D., et al. Resolvin D1 and aspirin-triggered resolvin D1 regulate histamine-stimulated conjunctival goblet cell secretion. Mucosal Immunology. 6, 1119-1130 (2013).
- Dartt, D. A., Masli, S. Conjunctival epithelial and goblet cell function in chronic inflammation and ocular allergic inflammation. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 14, 464-470 (2014).
- Mantelli, F., Argüeso, P. Functions of ocular surface mucins in health and disease. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 8, 477-483 (2008).
- García-Posadas, L., et al. Characterization and functional performance of a commercial human conjunctival epithelial cell line. Experimental Eye Research. 223, 109220 (2022).
- Shatos, M. A., et al. Isolation, characterization, and propagation of rat conjunctival goblet cells in vitro. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 42, 1455-1464 (2001).
- Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. Estrogenic activity of phenol red. Molecular and Cellular Endocrinology. 57, 169-178 (1988).
- Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 2496-2500 (1986).
- García-Posadas, L., et al. Interaction of IFN-γ with cholinergic agonists to modulate rat and human goblet cell function. Mucosal Immunology. 9, 206-217 (2016).
- Li, D., Jiao, J., Shatos, M. A., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Effect of VIP on intracellular [Ca2 ], extracellular regulated kinase 1/2, and secretion in cultured rat conjunctival goblet cells. Investigative Opthalmology & Visual Science. 54, 2872-2884 (2013).
- Contrò, V., et al. Sex steroid hormone receptors, their ligands, and nuclear and non-nuclear pathways. AIMS Molecular Science. 2, 294-310 (2015).
- Valley, C. C., Solodin, N. M., Powers, G. L., Ellison, S. J., Alarid, E. T. Temporal variation in estrogen receptor-alpha protein turnover in the presence of estrogen. Journal of Molecular Endocrinology. 40, 23-34 (2008).
- Campen, C. A., Gorski, J. Anomalous behavior of protein synthesis inhibitors on the turnover of the estrogen receptor as measured by density labeling. Endocrinology. 119, 1454-1461 (1986).
- Yang, M., et al. Sex-based differences in conjunctival goblet cell responses to pro-inflammatory and pro-resolving mediators. Scientific Reports. 12, 16305 (2022).
