In vitro Método para estudiar las diferencias basadas en el sexo en las células caliciformes conjuntivales
Summary
El medio libre de rojo fenol/fetal libre de suero bovino es una mejor opción que el RPMI avanzado para eliminar hormonas exógenas sin alterar la función normal de las células caliciformes conjuntivales en el estudio de las diferencias basadas en el sexo.
Abstract
El ojo seco es una enfermedad multifactorial que afecta a la salud de la superficie ocular, con una prevalencia profundamente mayor en las mujeres. La alteración de la mucina gelificadora que secretan las células caliciformes conjuntivales (CGC) en la superficie ocular contribuye a múltiples enfermedades de la superficie ocular. La eliminación de hormonas sexuales exógenas es esencial para obtener resultados consistentes durante el estudio in vitro de las diferencias basadas en el sexo en las CGC. En este trabajo se describe un método para minimizar la presencia de hormonas exógenas en el estudio de las diferencias basadas en el sexo en los CGC, manteniendo su función fisiológica. Los CGC de donantes humanos postmortem de ambos sexos se cultivaron a partir de trozos de la conjuntiva en medio RPMI con un 10% de suero fetal bovino (FBS) (denominado medio completo) hasta la confluencia. Casi 48 h antes del inicio de los experimentos, los CGC se transfirieron al medio RPMI sin rojo de fenol o FBS, pero con un 1% de BSA (lo que se conoce como medio libre de rojo de fenol). La función celular normal se estudió midiendo el aumento de [Ca 2+] ([Ca 2+]i) intracelular después de la estimulación con carbachol (Cch, 1 x 10-4 M) mediante microscopía de fura 2/acetoximetilo (AM). El resultado muestra que los CGC mantuvieron una función normal en los medios libres de rojo de fenol después de 48 h. No se observaron diferencias significativas en la respuesta [Ca2+]i entre el medio RPMI libre de rojo de fenol y el medio completo tras la estimulación con Cc. Por lo tanto, recomendamos utilizar el medio RPMI libre de rojo fenol con BSA al 1% para eliminar hormonas exógenas sin alterar la función normal de las CGC en el estudio de las diferencias basadas en el sexo.
Introduction
Las diferencias basadas en el sexo afectan a múltiples procesos de la superficie ocular 1,2,3. La manifestación clínica de estas diferencias basadas en el sexo es la diferencia en la prevalencia de muchas enfermedades de la superficie ocular entre hombres y mujeres, como el ojo seco y la conjuntivitis 4,5,6. La evidencia sugiere que las diferencias basadas en el sexo surgen de múltiples niveles biológicos, incluidos los diferentes perfiles de genes en los cromosomas X e Y7 y los efectos de las hormonas8. El estudio de las bases moleculares de las diferencias basadas en el sexo puede proporcionar una mejor comprensión de la enfermedad y, eventualmente, mejorar la medicina personalizada.
La superficie ocular comprende la película lagrimal suprayacente, la córnea y la conjuntiva. Se observan diferencias basadas en el sexo en múltiples componentes de la superficie ocular, incluyendo la película lagrimal 9,10, la córnea 11, la glándula lagrimal 12,13 y las glándulas de Meibomio que también secretan lágrimas 12. Numerosos estudios mecanicistas han investigado el efecto de las hormonas sexuales sobre la córnea y sus componentes asociados14,15; Sin embargo, se sabe poco sobre las diferencias basadas en el sexo en la conjuntiva y sus células caliciformes. La conjuntiva es una membrana mucosa que recubre la esclerótica y la superficie interna del párpado. El epitelio de la conjuntiva está compuesto por células escamosas estratificadas, estratificadas, no queratinizantes16.
Entre las células escamosas estratificadas de la conjuntiva, hay células caliciformes (CGC) intercaladas en la superficie apical del epitelio. Estas células caliciformes se caracterizan por el gran número de gránulos secretores localizados en el polo apical17. Los CGC sintetizan y secretan la mucina gelificadora MUC5AC para hidratar la superficie ocular y lubricarla durante el parpadeo17. La secreción de mucina está estrechamente regulada por la [Ca 2+] intracelular ([Ca 2+]i) y la activación de la quinasa regulada por señales extracelulares dependiente de Ras (ERK1/2)18. La incapacidad para secretar mucina provoca sequedad de la superficie ocular y secuelas de anomalías patológicas. Sin embargo, en una superficie ocular inflamada, la secreción extensa de mucina estimulada por mediadores inflamatorios conduce a una percepción de pegajosidad y picazón del ojo19. Estas condiciones con alteración de la secreción de mucina eventualmente conducirán al deterioro de la superficie ocular.
El papel de las células caliciformes como la principal fuente de mucina ocular ha sido reconocido desde hace mucho tiempo20, sin embargo, las diferencias basadas en el sexo en la regulación de la mucina tanto en estados fisiológicos como patológicos siguen sin descubrirse. Un sistema in vitro sería útil para monitorizar la función de las células caliciformes sin el efecto hormonal o con un nivel de hormonas sexuales controlado con precisión. A pesar de que se ha desarrollado una línea celular epitelial conjuntival21, no hay ninguna línea celular caliciforme con secreción funcional de mucina disponible. Por lo tanto, modificamos nuestro cultivo primario de CGC humano desarrollado para establecer un método para analizar la diferencia basada en el sexo in vitro16, y la presentamos como se muestra a continuación.
Protocol
Representative Results
Discussion
La investigación de las diferencias basadas en el sexo en los tejidos oculares ayuda a comprender los procesos de las enfermedades, especialmente el ojo seco y la conjuntivitis alérgica, que afectan de manera desproporcionada a un sexo 4,5,6. Aunque se pueden utilizar modelos animales para estos estudios, los datos obtenidos directamente de tejido humano son esenciales debido a la mayor similitud con las células humanas i…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El trabajo está financiado por el National Eye Institute Grant EY019470 (D.A.D).
Materials
| 0.05% trypsin with 1x EDTA | Gibco (Grand Island, NY) | 25300-054 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid | Fisher Bioreagent (Pittsburgh, PA) | BP310-500 | |
| Advanced RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 12633020 | |
| carbachol | Cayman Chemical (Ann Arbor, MI) | 144.86 | |
| Fetal Bovin Serum | R&D (Minneapolis, MN) | S11150H | |
| Fura-2- acetoxymethyl ester | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | F1221 | |
| Human conjunctival tissue | Eversight Eye Bank (Ann Arbor, MI) | N/A | |
| inorganic salt for KRB buffer | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | Any brand will work | |
| L-glutamine | Lonza Group (Basel, Switzerland) | 17-605F | |
| non-essential amino acids | Gibco (Grand Island, NY) | 11140-050 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco (Grand Island, NY) | 15140-122 | |
| phenol red-free RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 11835055 | |
| Pluronic acid F127 | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | P2443-250G | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco (Grand Island, NY) | 21875034 | |
| scalpel | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 12460451 | Any sterile surgical scalpel can work |
| sodium pyruvate | Gibco (Grand Island, NY) | 11360-070 | |
| sulfinpyrazone | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | S9509-5G |
Referências
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