In vitro Metod för att studera könsskillnader i bindhinnebägarceller
Summary
Fenolrött/fetalt bovint serumfritt medium är ett bättre alternativ än avancerad RPMI för att eliminera exogena hormoner utan att förändra den normala funktionen hos konjunktival bägarceller i studien av könsbaserade skillnader.
Abstract
Torra ögon är en multifaktoriell sjukdom som påverkar ögonytans hälsa, med en mycket högre prevalens hos kvinnor. Störning av det gelbildande mucinet som utsöndras av konjunktival bägarceller (CGC) på ögonytan bidrar till flera sjukdomar på ögats yta. Eliminering av exogena könshormoner är avgörande för att uppnå konsekventa resultat under in vitro-studier av könsbaserade skillnader i CGC. Denna artikel beskriver en metod för att minimera förekomsten av exogena hormoner i studiet av könsbaserade skillnader i CGC samtidigt som deras fysiologiska funktion bibehålls. CGC från postmortem mänskliga donatorer av båda könen odlades från bitar av bindhinnan i RPMI-medium med 10 % fetalt bovint serum (FBS) (kallat det kompletta mediet) fram till sammanflöde. Nästan 48 timmar före experimentens start överfördes CGC:er till RPMI-medium utan fenolrött eller FBS men med 1 % BSA (kallat fenol-rödfritt medium). Den normala cellulära funktionen studerades genom att mäta ökningen av intracellulär [Ca 2+] ([Ca2+]i) efter karbakolstimulering (Cch, 1 x 10-4 M) med hjälp av fura 2/acetoximetyl (AM) mikroskopi. Resultatet visar att CGC bibehöll normal funktion i det fenol-röd-fria mediet efter 48 timmar. Ingen signifikant skillnad i [Ca2+]i-svar observerades mellan fenol-rödfritt RPMI-medium och komplett medium vid Cch-stimulering. Därför rekommenderar vi att du använder det fenolrödfria RPMI-mediet med 1 % BSA för att eliminera exogena hormoner utan att förändra CGC:s normala funktion i studien av könsbaserade skillnader.
Introduction
Könsbaserade skillnader påverkar flera processer på ögonytan 1,2,3. Den kliniska manifestationen av dessa könsbaserade skillnader är skillnaden i prevalens av många ögonytesjukdomar mellan män och kvinnor, såsom torra ögon och konjunktivit 4,5,6. Det finns belägg för att könsbaserade skillnader beror på flera biologiska nivåer, bland annat genernas olika profiler på X- och Y-kromosomerna7 och hormonernas effekter8. Att studera den molekylära grunden för könsbaserade skillnader kan ge en bättre förståelse för sjukdomar och så småningom förbättra personlig medicin.
Den okulära ytan består av den överliggande tårfilmen, hornhinnan och bindhinnan. Könsbaserade skillnader observeras i flera komponenter i ögonytan, inklusive tårfilmen 9,10, hornhinnan 11, tårkörteln 12,13 och meibomska körtlar som också utsöndrar tårar 12. Många mekanistiska studier har undersökt effekten av könshormoner på hornhinnan och dess associerade komponenter14,15; Det finns dock inte mycket kunskap om de könsbaserade skillnaderna i bindhinnan och dess bägarceller. Bindhinnan är en slemhinna som täcker sklera och ögonlockets inre yta. Bindhinnans epitel består av icke-keratiniserande, flerskiktade, stratifierade skivepitelceller16.
Bland de stratifierade skivepitelcellerna i bindhinnan finns det bägarceller (CGC) insprängda på epitelets apikala yta. Dessa bägarceller kännetecknas av det stora antalet sekretoriska granuler som ligger vid den apikala polen17. CGC syntetiserar och utsöndrar det gelbildande mucinet MUC5AC för att återfukta ögonytan och smörja den under blinkning17. Mucinsekretionen regleras noggrant av det intracellulära [Ca 2+] ([Ca2+]i) och aktiveringen av det Ras-beroende extracellulära signalreglerade kinaset (ERK1/2)18. Oförmåga att utsöndra mucin resulterar i torrhet på ögonytan och följdsjukdomar av patologiska avvikelser. På en inflammerad okulär yta leder dock omfattande mucinutsöndring stimulerad av inflammatoriska mediatorer till en upplevelse av klibbighet och klåda i ögat19. Dessa tillstånd med störd mucinutsöndring kommer så småningom att leda till försämring av ögonytan.
Bägarcellernas roll som den viktigaste källan till okulärt mucin har länge varit erkänd20, men de könsbaserade skillnaderna i mucinreglering i både fysiologiska och patologiska tillstånd är fortfarande oupptäckta. Ett in vitro-system skulle vara användbart för att övervaka bägarcellernas funktion utan hormonell effekt eller med en exakt kontrollerad nivå av könshormoner. Även om en konjunktival epitelcellinje har utvecklats21, finns det ingen bägarcellinje med funktionell mucinsekretion tillgänglig. Därför modifierade vi vår utvecklade primära humana CGC-kultur för att etablera en metod för att analysera den könsbaserade skillnaden in vitro16 och presentera den enligt nedan.
Protocol
Representative Results
Discussion
Att undersöka könsbaserade skillnader i ögonvävnader hjälper till att förstå processerna för sjukdomar, särskilt torra ögon och allergisk konjunktivit, som oproportionerligt drabbar det ena könet 4,5,6. Även om djurmodeller kan användas för dessa studier är data som erhålls direkt från mänsklig vävnad viktiga på grund av den högsta likheten med de mänskliga cellerna in vivo. De konjunktivalvävnade…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbetet finansieras av National Eye Institute Grant EY019470 (D.A.D).
Materials
| 0.05% trypsin with 1x EDTA | Gibco (Grand Island, NY) | 25300-054 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid | Fisher Bioreagent (Pittsburgh, PA) | BP310-500 | |
| Advanced RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 12633020 | |
| carbachol | Cayman Chemical (Ann Arbor, MI) | 144.86 | |
| Fetal Bovin Serum | R&D (Minneapolis, MN) | S11150H | |
| Fura-2- acetoxymethyl ester | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | F1221 | |
| Human conjunctival tissue | Eversight Eye Bank (Ann Arbor, MI) | N/A | |
| inorganic salt for KRB buffer | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | Any brand will work | |
| L-glutamine | Lonza Group (Basel, Switzerland) | 17-605F | |
| non-essential amino acids | Gibco (Grand Island, NY) | 11140-050 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco (Grand Island, NY) | 15140-122 | |
| phenol red-free RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 11835055 | |
| Pluronic acid F127 | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | P2443-250G | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco (Grand Island, NY) | 21875034 | |
| scalpel | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 12460451 | Any sterile surgical scalpel can work |
| sodium pyruvate | Gibco (Grand Island, NY) | 11360-070 | |
| sulfinpyrazone | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | S9509-5G |
Referências
- Gao, Y., et al. Female-specific downregulation of tissue polymorphonuclear neutrophils drives impaired regulatory T cell and amplified effector T cell responses in autoimmune dry eye disease. Journal of Immunology. 195, 3086-3099 (2015).
- Wang, S. B., et al. Estrogen negatively regulates epithelial wound healing and protective lipid mediator circuits in the cornea. FASEB Journal. 26, 1506-1516 (2012).
- Sullivan, D. A., Block, L., Pena, J. D. Influence of androgens and pituitary hormones on the structural profile and secretory activity of the lacrimal gland. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 74, 421-435 (1996).
- Schaumberg, D. A., Dana, R., Buring, J. E., Sullivan, D. A. Prevalence of dry eye disease among US men: estimates from the Physicians’ Health Studies. Archives of Ophthalmology. 127, 763-768 (2009).
- Tellefsen Nøland, S., et al. Sex and age differences in symptoms and signs of dry eye disease in a Norwegian cohort of patients. The Ocular Surface. 19, 68-73 (2021).
- Sullivan, D. A., et al. TFOS DEWS II Sex, gender, and hormones report. The Ocular Surface. 15, 284-333 (2017).
- Meester, I., et al. SeXY chromosomes and the immune system: reflections after a comparative study. Biology of Sex Differences. 11, 3 (2020).
- Yang, J. -. H., et al. Hormone replacement therapy reverses the decrease in natural killer cytotoxicity but does not reverse the decreases in the T-cell subpopulation or interferon-gamma production in postmenopausal women. Fertility and Sterility. 74, 261-267 (2000).
- Orucoglu, F., Akman, M., Onal, S. Analysis of age, refractive error and gender related changes of the cornea and the anterior segment of the eye with Scheimpflug imaging. Contact Lens & Anterior Eye. 38, 345-350 (2015).
- Strobbe, E., Cellini, M., Barbaresi, U., Campos, E. C. Influence of age and gender on corneal biomechanical properties in a healthy Italian population. Cornea. 33, 968-972 (2014).
- Sullivan, D. A., Jensen, R. V., Suzuki, T., Richards, S. M. Do sex steroids exert sex-specific and/or opposite effects on gene expression in lacrimal and meibomian glands. Molecular Vision. 15, 1553-1572 (2009).
- Bukhari, A. A., Basheer, N. A., Joharjy, H. I. Age, gender, and interracial variability of normal lacrimal gland volume using MRI. Ophthalmic Plastic and Reconstructive Surgery. 30, 388-391 (2014).
- Sullivan, B. D., Evans, J. E., Dana, M. R., Sullivan, D. A. Influence of aging on the polar and neutral lipid profiles in human meibomian gland secretions. Archives of Ophthalmology. 124, 1286-1292 (2006).
- Ebeigbe, J. A., Ebeigbe, P. N. The influence of sex hormone levels on tear production in postmenopausal Nigerian women. African Journal of Medicine and Medical Sciences. 43, 205-211 (2014).
- Suzuki, T., et al. Estrogen’s and progesterone’s impact on gene expression in the mouse lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47, 158-168 (2006).
- Shatos, M. A., et al. Isolation and characterization of cultured human conjunctival goblet cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44, 2477-2486 (2003).
- Huang, A. J., Tseng, S. C., Kenyon, K. R. Morphogenesis of rat conjunctival goblet cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 29, 969-975 (1988).
- Li, D., et al. Resolvin D1 and aspirin-triggered resolvin D1 regulate histamine-stimulated conjunctival goblet cell secretion. Mucosal Immunology. 6, 1119-1130 (2013).
- Dartt, D. A., Masli, S. Conjunctival epithelial and goblet cell function in chronic inflammation and ocular allergic inflammation. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 14, 464-470 (2014).
- Mantelli, F., Argüeso, P. Functions of ocular surface mucins in health and disease. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 8, 477-483 (2008).
- García-Posadas, L., et al. Characterization and functional performance of a commercial human conjunctival epithelial cell line. Experimental Eye Research. 223, 109220 (2022).
- Shatos, M. A., et al. Isolation, characterization, and propagation of rat conjunctival goblet cells in vitro. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 42, 1455-1464 (2001).
- Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. Estrogenic activity of phenol red. Molecular and Cellular Endocrinology. 57, 169-178 (1988).
- Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 2496-2500 (1986).
- García-Posadas, L., et al. Interaction of IFN-γ with cholinergic agonists to modulate rat and human goblet cell function. Mucosal Immunology. 9, 206-217 (2016).
- Li, D., Jiao, J., Shatos, M. A., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Effect of VIP on intracellular [Ca2 ], extracellular regulated kinase 1/2, and secretion in cultured rat conjunctival goblet cells. Investigative Opthalmology & Visual Science. 54, 2872-2884 (2013).
- Contrò, V., et al. Sex steroid hormone receptors, their ligands, and nuclear and non-nuclear pathways. AIMS Molecular Science. 2, 294-310 (2015).
- Valley, C. C., Solodin, N. M., Powers, G. L., Ellison, S. J., Alarid, E. T. Temporal variation in estrogen receptor-alpha protein turnover in the presence of estrogen. Journal of Molecular Endocrinology. 40, 23-34 (2008).
- Campen, C. A., Gorski, J. Anomalous behavior of protein synthesis inhibitors on the turnover of the estrogen receptor as measured by density labeling. Endocrinology. 119, 1454-1461 (1986).
- Yang, M., et al. Sex-based differences in conjunctival goblet cell responses to pro-inflammatory and pro-resolving mediators. Scientific Reports. 12, 16305 (2022).
