Fenolrött/fetalt bovint serumfritt medium är ett bättre alternativ än avancerad RPMI för att eliminera exogena hormoner utan att förändra den normala funktionen hos konjunktival bägarceller i studien av könsbaserade skillnader.
Torra ögon är en multifaktoriell sjukdom som påverkar ögonytans hälsa, med en mycket högre prevalens hos kvinnor. Störning av det gelbildande mucinet som utsöndras av konjunktival bägarceller (CGC) på ögonytan bidrar till flera sjukdomar på ögats yta. Eliminering av exogena könshormoner är avgörande för att uppnå konsekventa resultat under in vitro-studier av könsbaserade skillnader i CGC. Denna artikel beskriver en metod för att minimera förekomsten av exogena hormoner i studiet av könsbaserade skillnader i CGC samtidigt som deras fysiologiska funktion bibehålls. CGC från postmortem mänskliga donatorer av båda könen odlades från bitar av bindhinnan i RPMI-medium med 10 % fetalt bovint serum (FBS) (kallat det kompletta mediet) fram till sammanflöde. Nästan 48 timmar före experimentens start överfördes CGC:er till RPMI-medium utan fenolrött eller FBS men med 1 % BSA (kallat fenol-rödfritt medium). Den normala cellulära funktionen studerades genom att mäta ökningen av intracellulär [Ca 2+] ([Ca2+]i) efter karbakolstimulering (Cch, 1 x 10-4 M) med hjälp av fura 2/acetoximetyl (AM) mikroskopi. Resultatet visar att CGC bibehöll normal funktion i det fenol-röd-fria mediet efter 48 timmar. Ingen signifikant skillnad i [Ca2+]i-svar observerades mellan fenol-rödfritt RPMI-medium och komplett medium vid Cch-stimulering. Därför rekommenderar vi att du använder det fenolrödfria RPMI-mediet med 1 % BSA för att eliminera exogena hormoner utan att förändra CGC:s normala funktion i studien av könsbaserade skillnader.
Könsbaserade skillnader påverkar flera processer på ögonytan 1,2,3. Den kliniska manifestationen av dessa könsbaserade skillnader är skillnaden i prevalens av många ögonytesjukdomar mellan män och kvinnor, såsom torra ögon och konjunktivit 4,5,6. Det finns belägg för att könsbaserade skillnader beror på flera biologiska nivåer, bland annat genernas olika profiler på X- och Y-kromosomerna7 och hormonernas effekter8. Att studera den molekylära grunden för könsbaserade skillnader kan ge en bättre förståelse för sjukdomar och så småningom förbättra personlig medicin.
Den okulära ytan består av den överliggande tårfilmen, hornhinnan och bindhinnan. Könsbaserade skillnader observeras i flera komponenter i ögonytan, inklusive tårfilmen 9,10, hornhinnan 11, tårkörteln 12,13 och meibomska körtlar som också utsöndrar tårar 12. Många mekanistiska studier har undersökt effekten av könshormoner på hornhinnan och dess associerade komponenter14,15; Det finns dock inte mycket kunskap om de könsbaserade skillnaderna i bindhinnan och dess bägarceller. Bindhinnan är en slemhinna som täcker sklera och ögonlockets inre yta. Bindhinnans epitel består av icke-keratiniserande, flerskiktade, stratifierade skivepitelceller16.
Bland de stratifierade skivepitelcellerna i bindhinnan finns det bägarceller (CGC) insprängda på epitelets apikala yta. Dessa bägarceller kännetecknas av det stora antalet sekretoriska granuler som ligger vid den apikala polen17. CGC syntetiserar och utsöndrar det gelbildande mucinet MUC5AC för att återfukta ögonytan och smörja den under blinkning17. Mucinsekretionen regleras noggrant av det intracellulära [Ca 2+] ([Ca2+]i) och aktiveringen av det Ras-beroende extracellulära signalreglerade kinaset (ERK1/2)18. Oförmåga att utsöndra mucin resulterar i torrhet på ögonytan och följdsjukdomar av patologiska avvikelser. På en inflammerad okulär yta leder dock omfattande mucinutsöndring stimulerad av inflammatoriska mediatorer till en upplevelse av klibbighet och klåda i ögat19. Dessa tillstånd med störd mucinutsöndring kommer så småningom att leda till försämring av ögonytan.
Bägarcellernas roll som den viktigaste källan till okulärt mucin har länge varit erkänd20, men de könsbaserade skillnaderna i mucinreglering i både fysiologiska och patologiska tillstånd är fortfarande oupptäckta. Ett in vitro-system skulle vara användbart för att övervaka bägarcellernas funktion utan hormonell effekt eller med en exakt kontrollerad nivå av könshormoner. Även om en konjunktival epitelcellinje har utvecklats21, finns det ingen bägarcellinje med funktionell mucinsekretion tillgänglig. Därför modifierade vi vår utvecklade primära humana CGC-kultur för att etablera en metod för att analysera den könsbaserade skillnaden in vitro16 och presentera den enligt nedan.
Att undersöka könsbaserade skillnader i ögonvävnader hjälper till att förstå processerna för sjukdomar, särskilt torra ögon och allergisk konjunktivit, som oproportionerligt drabbar det ena könet 4,5,6. Även om djurmodeller kan användas för dessa studier är data som erhålls direkt från mänsklig vävnad viktiga på grund av den högsta likheten med de mänskliga cellerna in vivo. De konjunktivalvävnade…
The authors have nothing to disclose.
Arbetet finansieras av National Eye Institute Grant EY019470 (D.A.D).
0.05% trypsin with 1x EDTA | Gibco (Grand Island, NY) | 25300-054 | |
4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid | Fisher Bioreagent (Pittsburgh, PA) | BP310-500 | |
Advanced RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 12633020 | |
carbachol | Cayman Chemical (Ann Arbor, MI) | 144.86 | |
Fetal Bovin Serum | R&D (Minneapolis, MN) | S11150H | |
Fura-2- acetoxymethyl ester | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | F1221 | |
Human conjunctival tissue | Eversight Eye Bank (Ann Arbor, MI) | N/A | |
inorganic salt for KRB buffer | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | Any brand will work | |
L-glutamine | Lonza Group (Basel, Switzerland) | 17-605F | |
non-essential amino acids | Gibco (Grand Island, NY) | 11140-050 | |
penicillin/streptomycin | Gibco (Grand Island, NY) | 15140-122 | |
phenol red-free RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 11835055 | |
Pluronic acid F127 | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | P2443-250G | |
RPMI-1640 culture medium | Gibco (Grand Island, NY) | 21875034 | |
scalpel | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 12460451 | Any sterile surgical scalpel can work |
sodium pyruvate | Gibco (Grand Island, NY) | 11360-070 | |
sulfinpyrazone | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | S9509-5G |