Evaluering av spindelenhetens kontrollpunktintegritet i museoocytter
Summary
Feil i kromosomsegregering er et vanlig trekk i oocytter. Derfor gir studier av spindelmonteringskontrollpunktet viktige ledetråder om mekanismene som trengs for å produsere sunne egg. Den nåværende protokollen beskriver tre komplementære analyser for å evaluere spindelmonteringens kontrollpunktintegritet i museoocytter.
Abstract
Aneuploidy er den ledende genetiske abnormiteten som forårsaker tidlig abort og graviditetssvikt hos mennesker. De fleste feil i kromosomsegregering som gir opphav til aneuploidi oppstår under meiose i oocytter, men hvorfor oocytmeiose er feilutsatt er fortsatt ikke fullt ut forstått. Under celledeling forhindrer celler feil i kromosomsegregering ved å aktivere spindelmonteringskontrollpunktet (SAC). Denne kontrollmekanismen er avhengig av å oppdage kinetochore (KT)-mikrotubuli (MT) vedlegg og føle spenning generert av spindelfibre. Når KT er ufestet, aktiveres SAC og forhindrer cellesyklusprogresjon. SAC aktiveres først av MPS1-kinase, som utløser rekruttering og dannelse av det mitotiske sjekkpunktkomplekset (MCC), sammensatt av MAD1, MAD2, BUB3 og BUBR1. Deretter diffunderer MCC inn i cytoplasma og sekvestrere CDC20, en anafasefremmende kompleks / syklosom (APC / C) aktivator. Når KT blir festet til mikrotubuli og kromosomer er justert ved metafaseplaten, blir SAC dempet, CDC20 frigjøres, og APC / C aktiveres, noe som utløser nedbrytningen av cyklin B og Securin, og derved tillater anafasestart. Sammenlignet med somatiske celler er SAC i oocytter ikke like effektiv fordi celler kan gjennomgå anafase til tross for at de ikke har festet KT. Å forstå hvorfor SAC er mer ettergivende, og hvis denne permissiviteten er en av årsakene til kromosomsegregeringsfeil i oocytter, trenger fortsatt ytterligere undersøkelser. Den nåværende protokollen beskriver de tre teknikkene for omfattende evaluering av SAC-integritet i museoocytter. Disse teknikkene inkluderer bruk av nocodazol for å depolymerisere MTs for å evaluere SAC-responsen, spore SAC-silencing ved å følge kinetikken til Securin-destruksjon og evaluere rekrutteringen av MAD2 til KT ved immunfluorescens. Sammen undersøker disse teknikkene mekanismer som trengs for å produsere sunne egg ved å gi en fullstendig evaluering av SACs integritet.
Introduction
Aneuploidi, som oppstår ved feil i kromosomsegregering, er den ledende årsaken til tidlige miscarriages og er sterkt knyttet til feil i meiose1. Meiose er forskjellig fra mitose fordi den består av to runder med celledeling uten et intervenerende DNA-replikasjonstrinn. I meiose I skilles homologe kromosomer mens søsterkromatider forblir sammen. I oocytter er dette trinnet feilutsatt, noe som fører til aneupploid eggproduksjon2.
For å forhindre kromosomsegregeringsfeil, aktiverer de fleste celletyper en overvåkingsmekanisme som pauser cellesyklusen, kalt spindelmonteringskontrollpunktet (SAC). Denne mekanismen registrerer kinetochore (KT)-mikrotubuli (MT) vedlegg og spenningen genereres når kromosomer er orientert på en bipolar måte3. Utilknyttede kinetokorer utløser en SAC-respons som starter med rekruttering av MPS1, hovedregulatoren til SAC, til kinetochores 3,4. MPS1 initierer rekruttering av andre SAC-komponenter, som fungerer som en plattform for å danne det mitotiske sjekkpunktkomplekset (MCC). MCC, sammensatt av MAD1, MAD2, BUB3 og BUBR1, diffunderer inn i cytoplasma og hemmer APC / C-aktivering ved å binde aktivatoren CDC20. Når alle kinetokorer er stabilt festet til MT og kromosomer er justert ved metafaseplaten, blir SAC dempet, og MCC demonterer og frigjør CDC20, og tillater dermed APC / C-aktivering. Aktiv APC/C nedbryter Securin og Cyclin B, to viktige trinn i å utløse anafaseutbrudd 5,6. I somatiske celler er SAC streng fordi den aktiveres av en enkelt ufestet kinetochore og er tilstrekkelig til å indusere cellesyklusstans6. Under oocytmeiose er SAC imidlertid mer ettergivende, og oocytter kan gå inn i anafase I med en eller flere ufestede kinetokorer 6,7,8,9,10. Å forstå hvorfor SAC er mer ettergivende i oocytter er et pågående fokusområde i feltet. Mekanismer som forårsaker defekter i SAC-aktivering eller SAC-deaktivering kan føre til feil i kromosomsegregering eller langvarig cellesyklusarrest og celledød. Derfor er evaluering av mekanismene som opprettholder SAC-integritet i oocytter viktig for å forstå prosessen med å danne sunne, euploide egg.
Denne protokollen beskriver teknikker for omfattende evaluering av SAC-integriteten i museoocyttmeiose ved å undersøke forskjellige kritiske trinn i sjekkpunktet. Først beskrives evalueringen av SAC-responsen etter indusering av SAC-aktivering. Denne aktiveringen oppnås ved å generere ikke-tilknyttede kinetokorer ved bruk av nocodazol, et stoff som depolymeriserer MTs11. For det andre beskrives en metode for å overvåke SAC-silencing ved å spore dynamikken i Securin-nedbrytning under oocytmodning. Til slutt brukes en immunfluorescensbasert analyse for å måle rekrutteringen av MAD2, en av MCC-komponentene, til kinetochores. Sammen vurderer disse analysene SAC-integriteten grundig under oocytmeiotisk modning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kontrollpunktet for spindelmontering er en kritisk kontrollmekanisme under celledeling designet for å forhindre kromosomsegregeringsfeil. Det gjør at cellen får nok tid til å korrigere feil KT-MT-vedlegg. Meiose i oocytter er en feilutsatt prosess, hvor det meste av kromosom-missegregeringen oppstår under meiose I, noe som fører til generering av aneuploide egg som er hovedårsaken til tidlige spontanaborter og infertilitet hos mennesker 1,24. Flere hypotes…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansiering for dette prosjektet ble gitt av National Institutes of Health (R35GM136340 til KS).
Materials
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | |
| Dimethyl-sulfoxide (DMSO) | Sigma | D5879 | |
| Donkey-anti-rabbit-Alexa-568 | Life Technologies | A10042 | |
| EVOS FL Auto Imaging System | Life Technologies | Fluorescence microscope | |
| EVOS Onstage Incubator | Life Technologies | Incubator chamber | |
| Glass Bottom 96- well plates N 1.5 uncoated | MatTek Corporation | P96G-1.5-5-F | |
| goat-anti-human-Alexa-633 | Life Technologies | A21091 | |
| HEPES | Sigma | H3537 | |
| Human anti-ACA | Antibodies Incorporated | 15-234 | Dilution 1/30 |
| ImageJ | NIH | ||
| KCl | Sigma | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Leica SP8 equipped with a 63×, 1.40 NA oil immersion objective | Leica | ||
| MgSO4·7H20 | Sigma | M7774 | |
| Milrinone | Sigma | M4659 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S2429 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaN3 | Sigma | S2002 | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| Paraformaldhyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| Rabbit anti- MAD2 | Biolegend | 924601 | Dilution 1/1000; previously Covance #PRB-452C |
| Reversine | Cayman Chemical | 10004412 | |
| Triton-X | Sigma | 274348 | |
| Tween-20 | Sigma | X100 | |
| Vectashield | Vector laboratories | H-1000 |
Referências
- Gruhn, J. R., et al. Chromosome errors in human eggs shape natural fertility over reproductive life span. Science. 365 (6460), 1466-1469 (2019).
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews. Genetics. 13 (7), 493-504 (2012).
- Musacchio, A. The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics. Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).
- Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. The spindle assembly checkpoint. Current Biology. 22 (22), 966-980 (2012).
- London, N., Biggins, S. Signalling dynamics in the spindle checkpoint response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 736-748 (2014).
- Kuhn, J., Dumont, S. Mammalian kinetochores count attached microtubules in a sensitive and switch-like manner. Journal of Cell Biology. 218 (11), 3583-3596 (2019).
- Jones, K. T., Lane, S. I. R. Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs. Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).
- Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
- Nagaoka, S. I., Hodges, C. A., Albertini, D. F., Hunt, P. A. Oocyte-specific differences in cell-cycle control create an innate susceptibility to meiotic errors. Current Biology. 21 (8), 651-657 (2011).
- Sebestova, J., Danylevska, A., Novakova, L., Kubelka, M., Anger, M. Lack of response to unaligned chromosomes in mammalian female gametes. Cell Cycle. 11 (16), 3011-3018 (2012).
- Vasquez, R. J., Howell, B., Yvon, A. M., Wadsworth, P., Cassimeris, L. Nanomolar concentrations of nocodazole alter microtubule dynamic instability in vivo and in vitro. Molecular Biology of the Cell. 8 (6), 973-985 (1997).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. Journal of Visualized Experiments. (53), e2851 (2011).
- Thomas, R. E., Thompson, J. G., Armstrong, D. T., Gilchrist, R. B. Effect of specific phosphodiesterase isoenzyme inhibitors during in vitro maturation of bovine oocytes on meiotic and developmental capacity. Biology of Reproduction. 71 (4), 1142-1149 (2004).
- Marin, D., Nguyen, A. L., Scott, R. T., Schindler, K. Using mouse oocytes to assess human gene function during meiosis I. Journal of Visualized Experiments. (134), e57442 (2018).
- Herbert, M., et al. Homologue disjunction in mouse oocytes requires proteolysis of securin and cyclin B1. Nature Cell Biology. 5 (11), 1023-1025 (2003).
- Solc, P., et al. Multiple requirements of PLK1 during Mouse oocyte maturation. PLoS One. 10 (2), 0116783 (2015).
- Blengini, C. S., Nguyen, A. L., Aboelenain, M., Schindler, K. Age-dependent integrity of the meiotic spindle assembly checkpoint in females requires Aurora kinase B. Aging Cell. 20 (11), 13489 (2021).
- Balboula, A. Z., et al. Haspin kinase regulates microtubule-organizing center clustering and stability through Aurora kinase C in mouse oocytes. Journal of Cell Science. 129 (19), 3648-3660 (2016).
- Nabti, I., Grimes, R., Sarna, H., Marangos, P., Carroll, J. Maternal age-dependent APC/C-mediated decrease in securin causes premature sister chromatid separation in meiosis II. Nature Communications. 8 (1), 15346 (2017).
- Blengini, C. S., Schindler, K. Immunofluorescence technique to detect subcellular structures critical to oocyte maturation. Methods in Molecular Biology. 1818, 67-76 (2018).
- Santaguida, S., Tighe, A., D’Alise, A. M., Taylor, S. S., Musacchio, A. Dissecting the role of MPS1 in chromosome biorientation and the spindle checkpoint through the small molecule inhibitor reversine. Journal of Cell Biology. 190 (1), 73-87 (2010).
- Musacchio, A. The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics. Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).
- Wassmann, K., Niault, T., Maro, B. Metaphase I arrest upon activation of the Mad2-dependent spindle checkpoint in mouse oocytes. Current Biology. 13 (18), 1596-1608 (2003).
- Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going. Human Molecular Genetics. 16, 203-208 (2007).
- Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
- Homer, H. A., et al. Mad2 prevents aneuploidy and premature proteolysis of cyclin B and securin during meiosis I in mouse oocytes. Genes and Development. 19 (2), 202-207 (2005).
- Blengini, C. S., et al. Aurora kinase A is essential for meiosis in mouse oocytes. PLOS Genetics. 17 (4), 1009327 (2021).
- Hagting, A., et al. Human securin proteolysis is controlled by the spindle checkpoint and reveals when the APC/C switches from activation by Cdc20 to Cdh1. Journal of Cell Biology. 157 (7), 1125-1137 (2002).
- Rodriguez-Rodriguez, J. A., et al. Distinct roles of RZZ and Bub1-KNL1 in mitotic checkpoint signaling and kinetochore expansion. Current Biology. 28 (21), 3422-3429 (2018).
- Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes. Methods in Molecular Biology. 957, 203-212 (2013).
