Het huidige protocol beschrijft de extractie van lumican uit het vruchtwatermembraan (AM) en hun opslagcondities als AM-extract (AME) bij -20 °C, 4 °C en kamertemperatuur (RT) gedurende 6, 12, 20 en 32 dagen om de eiwitten en lumicanconcentratie te kwantificeren.
Lumican is een klein leucine-rijk proteoglycaan in het menselijk vruchtwatermembraan (AM) dat cornea-epithelisatie en de organisatie van collageenvezels bevordert, waardoor de transparantie van het hoornvlies behouden blijft. In het huidige werk wordt een methode voor eiwitextractie uit AM voorgesteld om lumican te verkrijgen. Daarnaast wordt de stabiliteit van lumican in het AM-extract (AME) opgeslagen bij verschillende temperaturen en tijdsperioden geëvalueerd. 100 mg AM werd ontdooid en mechanisch gedepitheliseerd. De gedepitheliseerde AM werd ingevroren en geplet totdat een fijn poeder werd verkregen, dat werd opgelost met 2,5 ml zoutoplossingsbuffer met proteaseremmers en gecentrifugeerd voor eiwitextractie. Het supernatant werd verzameld en bewaard bij -20 °C, 4 °C en kamertemperatuur (RT) gedurende 6, 12, 20 en 32 dagen. Daarna werd lumican in elke AME gekwantificeerd. Deze techniek maakt een toegankelijk en acquireerbaar protocol mogelijk voor lumican extractie uit AM. De Lumican-concentratie werd beïnvloed door de opslagtijd en temperatuuromstandigheden. Lumican in de AME van 12 dagen bewaard bij -20 °C en 4 °C was significant hoger dan andere AME. Deze lumican-extractie kan nuttig zijn voor het ontwikkelen van behandelingen en farmaceutische oplossingen. Verdere studies zijn nodig om het gebruik van AME lumican in re-epithelisatie en wondgenezingsproces te bepalen.
Een van de meest gebruikte behandelingen voor cornea-aandoeningen is vruchtwatermembraantransplantatie; in de afgelopen jaren zijn er echter nieuwe voorstellen ontstaan voor het gebruik van verschillende componenten van vruchtwater als alternatieve en adjuvante behandelingen. Een van de meest bestudeerde componenten van AM zijn die verkregen uit het AM-extract (AME)1,2,3,4,5,6,7. AM bevat meerdere oplosbare factoren zoals antiangiogene eiwitten, interleukines (IL), weefselremmers van metalloproteinasen (TIMPs), ontstekingsremmende eiwitten gemedieerd door TSG-6 die neutrofiele extracellulaire vallen remmen, groeifactoren: epidermale groeifactor (EGF), transformerende groeifactor (TGF) (alfa en bèta), keratinocytengroeifactor (KGF), hepatocytengroeifactor (HGF) en lumican, die de transparantie van het hoornvlies handhaaft door collageenfibrillogenesete reguleren 1, 2,3,4,5,6,7,8,9.
Lumican is een kleine leucinerijke proteoglycaan (SLRP), een van de belangrijkste extracellulaire componenten van interstitieel collagenase in de corneastromamamatrix, verantwoordelijk voor het organiseren van collageenvezels en het handhaven van corneatransparantie 4,10,11. Proteoglycanen zijn moleculen in de extracellulaire matrix (ECM), die de belangrijkste zijn bij het uitvoeren van celsignalering en het handhaven van intracellulaire homeostase12. Van ECM-eiwitten is gemeld dat ze de cellulaire processen van proliferatie, differentiatie en migratie tijdens wondgenezing stimuleren11.
Er zijn aanwijzingen voor de mogelijke deelname van lumican aan het proces van cornea-re-epithelisatie. Saika et al., in een studie, toonden aan dat na een hoornvliesletsel, lumican kon worden gedetecteerd in corneale keratocyten tussen de eerste 8 uur en tot 3 dagen na het letsel. Met de hoogste concentratie lumican op de tweede en derde dag, is dit proteoglycaan vervolgens niet detecteerbaar op de zevende dag13. Deze gegevens suggereren de deelname van lumican aan de activering van het cornea-epithelisatieproces. Aan de andere kant werd in een andere studie gemeld dat de afwezigheid van lumican de re-epithelisatie vertraagt; interessant is dat het toevoegen van lumican het re-epithelisatieproces zou kunnen versnellen 4,11,13. Evenzo heeft een recente studie gemeld dat lumican de ontstekingsfuncties van corneale limbus fibroblasten14 kan moduleren, wat een rol suggereert voor lumican als modulator van de inflammatoire, antifibrotische en re-epithelialiserende respons. Op dezelfde manier kan lumican de cornearespons moduleren door interactie met signaalmoleculen zoals Fas-FasL. Ook toonde de afwezigheid van lumican in een knock-out Lum-/- muismodel aan dat het ontbreken van lumican-signalering een adequate hoornvliesreparatie verhindert15.
In de eerste plaats is deze methode bedoeld om een haalbare en toegankelijke manier te demonstreren om lumican uit AM te extraheren. Met deze voordelige methode van lumican-extractie is het mogelijk om vergelijkbare concentraties eiwitten te verkrijgen, waardoor de verwerkingstijd wordt verkort en het voor onderzoekers gemakkelijker wordt in vergelijking met de vorige studies16. Bovendien kan deze AME-lumican worden gebruikt als adjuvans voor corneaherstel en re-epithelisatieprocessen.
In deze studie werd de aanwezigheid van lumican in de AME geanalyseerd en de directe correlatie met de stabiliteit onder verschillende opslagomstandigheden. Interessant is dat wanneer de totale eiwitconcentratie in AME werd gekwantificeerd, de eiwitconcentratie na opslag toenam. Er zijn aanwijzingen voor drie mechanismen die de eiwitconcentratie in bevroren opslag kunnen veranderen: koude denaturatie, de bevroren concentratie van opgeloste stoffen en door ijs geïnduceerde gedeeltelijke ontplooiing van eiwitstructuur<sup…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.
1 N H2SO4 stop solution | R&D Systems | DY994 | |
100 μL micropipette | Eppendorf | ||
1000 μL micropipette | Eppendorf | ||
15 mm Petri dish | Symlaboratorios | ||
18 G Needle (1.2 mm x 40 mm) | BD Becton Dickinson | 305211 | |
2 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | Z606340 | |
20 mL plastic syringe | BD Becton Dickinson | 302562 | |
20 μL micropipette | Eppendorf | ||
20-200 μL micropipette | Eppendorf | ||
5 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | 30119401 | |
96-well microplate | SARSTEDT | 821581 | |
Aluminum foil | N/A | N/A | |
Amniotic membrane | Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana Amnion Bank | 100 mg | |
Balanced salt solution | Bausch + Lomb | BSS-403802 | |
Beaker | N/A | N/A | |
BioRender | BioRender | figures design | |
Compact Rocker | BioRad | 970822DD | Mod. 5202SD-BIO |
complete, EDTA-free, Protease inhibitor cocktail tablets |
Roche | 11 873 580 001 | Protease Inhibitor |
Daiggner vortex Genie 2 | A.Daigger & Co. , INC | 22220A | |
Dispase II | Gibco | 17105-041 | |
ELISA plate spectrometer | Thermo Labsystems | 35401106 | Multiscan |
Freezer | |||
GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc | version 9 | statistical analysis and graphic program |
Human lumican DuoSet ELISA kit | R&D Systems | DY2846-05 | includes human Lumican capture antibody |
Incubator | Forma Scientific | 3326 S/N 36481-7002 | |
Inverted light Microscope | Olympus | 6A13921 | to confirm de-epithelialization Mod.CK2 |
Laminar flow hood | Forma Scientific | 14753-567 | Mod.1184 |
Liquid nitrogen | N/A | N/A | |
Mortar | N/A | N/A | |
Multi-channel pipettor | Eppendorf | ||
Nitrogen Tank | Thermo Scientific | Mod. Biocan 20 | |
Paper towels | N/A | N/A | |
Phosphate-buffered saline | R&D Systems | DY006 | |
Pierce Modified Lowry Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23240 | |
Plate sealers | R&D Systems | DY992 | |
Reagent diluent | R&D Systems | DY995 | 1% BSA in PBS, pH 7.2-7.4, 0.2 μm filtered |
Refrigerated centrifuge | centurion scientific Ltd | 15877 | Mod. K2015R |
Rubber policeman cell scraper | NEST | 710001 | for mechanical de-epithelialization |
Scalpel knife | Braun | BB521 | No. 10 or 21 |
Streptavidin-HRP 40-fold concentrated | R&D Systems | part 893975 | |
Substrate tetramethylbenzidine (TMB) solution | R&D Systems | DY999 | |
Toothed tweezers | Invent Germany | 6b | inox |
Ultrapure water | PISA | ||
Wash buffer | R&D Systems | WA126 | 0.05% Tween 20 in PBS, pH 7.2-7.4 |