विट्रो में इस्केमिक स्ट्रोक का अध्ययन करने के लिए मानव रक्त-मस्तिष्क बाधा का एक ट्रिपल प्राथमिक सेल संस्कृति मॉडल
Summary
यहां, हम प्राथमिक मानव मस्तिष्क माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं, एस्ट्रोसाइट्स और पेरिसाइट के आधार पर रक्त-मस्तिष्क बाधा के ट्रिपल सेल कल्चर मॉडल की स्थापना के लिए विधि का वर्णन करते हैं। यह बहुकोशिकीय मॉडल विट्रो में इस्केमिक स्ट्रोक के दौरान न्यूरोवास्कुलर यूनिट डिसफंक्शन के अध्ययन के लिए या दवा उम्मीदवारों की स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त है।
Abstract
इस्केमिक स्ट्रोक सीमित चिकित्सीय विकल्पों के साथ दुनिया भर में मृत्यु और विकलांगता का एक प्रमुख कारण है। इस्केमिक स्ट्रोक के न्यूरोपैथोलॉजी को मस्तिष्क में रक्त की आपूर्ति में रुकावट की विशेषता है जिससे कोशिका मृत्यु और संज्ञानात्मक शिथिलता होती है। इस्केमिक स्ट्रोक के दौरान और बाद में, रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) शिथिलता चोट की प्रगति की सुविधा प्रदान करती है और खराब रोगी वसूली में योगदान देती है। वर्तमान बीबीबी मॉडल में मुख्य रूप से एंडोथेलियल मोनोकल्चर और एस्ट्रोसाइट्स या पेरिसाइट के साथ डबल सह-संस्कृतियां शामिल हैं।
ऐसे मॉडलों में एक गतिशील मस्तिष्क माइक्रोएन्वायरमेंट की पूरी तरह से नकल करने की क्षमता की कमी होती है, जो सेल-टू-सेल संचार के लिए आवश्यक है। इसके अतिरिक्त, आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले बीबीबी मॉडल में अक्सर अमर मानव एंडोथेलियल कोशिकाएं या पशु-व्युत्पन्न (कृंतक, पोर्सिन, या गोजातीय) सेल संस्कृतियां होती हैं जो ट्रांसलेशनल सीमाएं पैदा करती हैं। यह पेपर एक उपन्यास अच्छी तरह से सम्मिलित-आधारित बीबीबी मॉडल का वर्णन करता है जिसमें केवल प्राथमिक मानव कोशिकाएं (मस्तिष्क माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाएं, एस्ट्रोसाइट्स और मस्तिष्क संवहनी पेरिसाइट्स) होती हैं जो विट्रो में इस्केमिक मस्तिष्क की चोट की जांच को सक्षम करती हैं।
बाधा अखंडता पर ऑक्सीजन-ग्लूकोज अभाव (ओजीडी) के प्रभावों का मूल्यांकन निष्क्रिय पारगम्यता, ट्रांसेंडोथेलियल विद्युत प्रतिरोध (टीईईआर) माप और हाइपोक्सिक कोशिकाओं के प्रत्यक्ष विज़ुअलाइज़ेशन द्वारा किया गया था। प्रस्तुत प्रोटोकॉल विवो में बीबीबी के अंतरकोशिकीय वातावरण को कम करने में एक अलग लाभ प्रदान करता है, जो इस्केमिक मस्तिष्क की चोट की स्थापना में नई चिकित्सीय रणनीतियों को विकसित करने के लिए अधिक यथार्थवादी इन विट्रो बीबीबी मॉडल के रूप में कार्य करता है।
Introduction
स्ट्रोकदुनिया भर में मृत्यु और दीर्घकालिक विकलांगता के प्रमुख कारणों में से एक है। स्ट्रोक की घटनाएं उम्र के साथ तेजी से बढ़ती हैं, 55 वर्ष की आयु के बाद हर 10 साल मेंदोगुनी हो जाती हैं। इस्केमिक स्ट्रोक थ्रोम्बोटिक और एम्बोलिक घटनाओं के कारण सेरेब्रल रक्त प्रवाह व्यवधान के परिणामस्वरूप होता है, जिसमें सभी स्ट्रोक के मामलों का 80% से अधिक शामिल होताहै। अब भी, इस्केमिक स्ट्रोक के बाद ऊतक मृत्यु को कम करने के लिए अपेक्षाकृत कम उपचार विकल्प उपलब्ध हैं। जो उपचार मौजूद हैं वे समय-संवेदनशील हैं और परिणामस्वरूप हमेशा अच्छे नैदानिक परिणाम नहीं होते हैं। इसलिए, पोस्टस्ट्रोक रिकवरी को प्रभावित करने वाले इस्केमिक स्ट्रोक के जटिल सेलुलर तंत्र पर शोध की तत्काल आवश्यकता है।
बीबीबी रक्त और मस्तिष्क पैरेन्काइमा के बीच अणुओं के आदान-प्रदान के लिए एक गतिशील इंटरफ़ेस है। संरचनात्मक रूप से, बीबीबी में मस्तिष्क माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाएं शामिल हैं जो एक तहखाने झिल्ली, पेरिसाइट और एस्ट्रोसाइटिक एंडफीट4 से घिरे जंक्शनल कॉम्प्लेक्स से जुड़ी हुई हैं। पेरिसाइट्स और एस्ट्रोसाइट्स मजबूत, तंग जंक्शनोंके गठन के लिए आवश्यक विभिन्न कारकों के स्राव के माध्यम से बीबीबी अखंडता के रखरखाव में एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं। बीबीबी का टूटना इस्केमिक स्ट्रोक की पहचान में से एक है। सेरेब्रल इस्किमिया से जुड़ी तीव्र भड़काऊ प्रतिक्रिया और ऑक्सीडेटिव तनाव के परिणामस्वरूप एस्ट्रोसाइट्स, पेरिसाइट और एंडोथेलियल कोशिकाओं के बीच तंग जंक्शन प्रोटीन कॉम्प्लेक्स और डिसरेगुलेटेड क्रॉसस्टॉक का विघटन होता है, जिससे बीबीबी 7 में पैरासेल्युलर विलेय पारगम्यता बढ़ जातीहै। बीबीबी डिसफंक्शन मस्तिष्क एडिमा के गठन को बढ़ावा देता है और रक्तस्रावी परिवर्तन के जोखिम को बढ़ाताहै। उपरोक्त सभी को ध्यान में रखते हुए, इस्केमिक स्ट्रोक के दौरान और बाद में बीबीबी स्तर पर होने वाले आणविक और सेलुलर परिवर्तनों को समझने में बहुत रुचि है।
यद्यपि कई इन विट्रो बीबीबी मॉडल हाल के दशकों में विकसित किए गए हैं और विभिन्न अध्ययनों में उपयोग किए जाते हैं, उनमें से कोई भी विवो स्थितियों9 में पूरी तरह से प्रतिकृति नहीं कर सकता है। जबकि कुछ मॉडल एंडोथेलियल सेल मोनोलेयर पर आधारित होते हैं, जो अकेले या पेरिसाइट या एस्ट्रोसाइट्स के साथ संयोजन में अच्छी तरह से सम्मिलित पारगम्य समर्थन पर सुसंस्कृत होते हैं, केवल हाल के अध्ययनों ने ट्रिपल सेल कल्चर मॉडल डिज़ाइन पेश किए हैं। लगभग सभी मौजूदा ट्रिपल कल्चर बीबीबी मॉडल में पशु प्रजातियों या मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त कोशिकाओं से अलग एस्ट्रोसाइट्स और पेरिसाइटके साथ प्राथमिक मस्तिष्क एंडोथेलियल कोशिकाएं शामिल हैं।
इन विट्रो में मानव बीबीबी को बेहतर ढंग से पुन: प्राप्त करने की आवश्यकता को पहचानते हुए, हमने मानव मस्तिष्क माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं (एचबीएमईसी), प्राथमिक मानव एस्ट्रोसाइट्स (एचए), और प्राथमिक मानव मस्तिष्क संवहनी पेरिसाइट्स (एचपीवीपी) से बना एक ट्रिपल सेल कल्चर इन विट्रो बीबीबी मॉडल की स्थापना की। यह ट्रिपल कल्चर बीबीबी मॉडल 6-वेल प्लेट पर स्थापित किया गया है, पॉलिएस्टर झिल्ली 0.4 μm छिद्र आकार के साथ सम्मिलित है। ये अच्छी तरह से सम्मिलित सेल लगाव के लिए एक इष्टतम वातावरण प्रदान करते हैं और मध्यम नमूनाकरण या यौगिक अनुप्रयोग के लिए एपिकल (रक्त) और बेसोलेटरल (मस्तिष्क) दोनों डिब्बों तक आसान पहुंच को सक्षम करते हैं। इस प्रस्तावित ट्रिपल सेल कल्चर बीबीबी मॉडल की विशेषताओं का मूल्यांकन टीईईआर और पैरासेलुलर फ्लक्स पोस्ट ओजीडी को मापकर किया जाता है, जिसमें ऑक्सीजन की कमी (<1% ओ2) और पोषक तत्वों (ग्लूकोज मुक्त माध्यम का उपयोग करके) एक ह्यूमिडिफाइड, सीलबंद कक्ष का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है। इसके अतिरिक्त, इस मॉडल में प्रेरित इस्केमिक जैसी स्थितियों को हाइपोक्सिक कोशिकाओं के प्रत्यक्ष विज़ुअलाइज़ेशन द्वारा सटीक रूप से सत्यापित किया जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में, हम विट्रो में इस्केमिक स्ट्रोक की स्थापना में बीबीबी डिसफंक्शन का अध्ययन करने के लिए एक विश्वसनीय ट्रिपल एंडोथेलियल सेल-पेरिसाइट-एस्ट्रोसाइट कल्चर बीबीबी मॉडल स्थापित करने की ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) अनुदान एमएच 128022, एमएच 122235, एमएच 072567, एमएच 122235, एचएल 126559, डीए044579, डीए039576, डीए040537, डीए050528 और डीए047157 द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert | Corning | 3450 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Life Sciences (FISHERSCI) | P35GC-1.5-14-C | |
| Astrocyte Medium | Science Cell | 1801 | |
| Attachment Factor | Cell Systems (Fisher Scientific) | 4Z0-201 | |
| BD 60 mL Syringe | BD | 309653 | |
| BrainPhys Imaging Optimized Medium | STEMCELL Technologies | 5791 | |
| Complete Classic Medium With Serum and CultureBoost | 4Z0-500 | Cell Systems | |
| Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes (Conical Bottom with CentriStar Cap | VWR | 430829 | |
| Corning 75cm² U-Shaped Canted Neck Not Treated Cell Culture Flask | Corning | 431464U | |
| Corning CellBIND 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates | Corning | 3340 | |
| Countes Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | ZGEXSCCOUNTESS2FL | |
| Decon CiDehol 70 Isopropyl Alcohol Solution | Fisher Scientific | 04-355-71 | |
| Disposable Petri Dishes | VWR | 25384-088 | |
| DMEM Medium (No glucose, No glutamine, No phenol red) | ThermoFisher | A14430-01 | Glucose-free medium |
| DPBS (No Calcium, No Magnesium) | ThermoFisher | 14190250 | |
| EBM Endothelial Cell Growth Basal Medium, Phenol Red Free, 500 mL | Lonza | CC-3129 | |
| EVOM2 Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter with STX2 electrodes | World Precison Instruments | NC9792051 | Epithelial voltohmmeter |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 20,000) | Millipore Sigma | FD20-250MG | |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 70,000) | Millipore Sigma | FD70S-250MG | |
| Fluorview FV3000 Confocal Microscope | Olympus | FV3000 | |
| Gas Tank (95% N2, 5% CO2) | Airgas | X02NI95C2003071 | |
| HBSS (No calcium, No magnesium, no phenol red) | Thermofisher | 14025092 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate – 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | |
| Human Astrocytes | Science Cell | 1800 | |
| Human Brain Vascular Pericytes | Science Cell | 1200 | |
| Hypoxia Incubator Chamber | STEMCELL Technologies | 27310 | |
| Image-iT Green Hypoxia Reagent | ThermoFisher | I14834 | |
| Pericyte Medium | Science Cell | 1201 | |
| Primary Human Brain Microvascular Endothelial Cells | ACBRI 376 | Cell Systems | |
| Rocking Platform Shaker, Double | VWR | 10860-658 | |
| Single Flow Meter | STEMCELL Technologies | 27311 | |
| SpectraMax iD3 Microplate Reader | Molecular Devices | 75886-128 | |
| Syringe Filter, 25 mm, 0.22 μm, PVDF, Sterile | NEST Scientific | 380121 | |
| TPP Mutli-well Plates (6 wells) | MidSci | TP92406 | |
| TPP Tissue Culture Flasks T-75 Flasks | MidSci | TP90075 | Flasks with activated surface for cell adhesion |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher | 25200056 | |
| UltraPure Distilled Water | Invitrogen (Life Technologies) | 10977-015 | |
| Uno Stage Top Incubator- | Oko Lab | UNO-T-H-CO2-TTL |
Referências
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