시험관 내 허혈성 뇌졸중 연구를 위한 인간 혈액-뇌 장벽의 삼중 일차 세포 배양 모델
Summary
여기에서는 일차 인간 뇌 미세 혈관 내피 세포, 성상 세포 및 혈관 주위 세포를 기반으로 혈액 뇌 장벽의 삼중 세포 배양 모델을 구축하는 방법을 설명합니다. 이 다세포 모델은 시험관 내 허혈성 뇌졸중 중 신경 혈관 단위 기능 장애의 연구 또는 약물 후보의 스크리닝에 적합합니다.
Abstract
허혈성 뇌졸중은 치료 옵션이 제한된 전 세계적으로 사망 및 장애의 주요 원인입니다. 허혈성 뇌졸중의 신경 병리학은 뇌로의 혈액 공급 중단으로 세포 사멸 및인지 기능 장애를 일으키는 특징이 있습니다. 허혈성 뇌졸중 중 및 후에 혈액-뇌장벽(BBB) 기능 장애는 부상 진행을 촉진하고 환자 회복 불량에 기여합니다. 현재의 BBB 모델은 주로 내피 단일 배양 및 성상 세포 또는 pericytes와의 이중 공동 배양을 포함합니다.
이러한 모델은 세포 간 통신에 필수적인 동적 뇌 미세 환경을 완전히 모방하는 능력이 부족합니다. 또한 일반적으로 사용되는 BBB 모델에는 종종 불멸화 된 인간 내피 세포 또는 번역 제한이 있는 동물 유래(설치류, 돼지 또는 소) 세포 배양이 포함됩니다. 이 논문은 시험관 내에서 허혈성 뇌 손상의 조사를 가능하게 하는 일차 인간 세포(뇌 미세혈관 내피 세포, 성상세포 및 뇌 혈관 혈관주위세포)만 포함하는 새로운 웰 삽입 기반 BBB 모델을 설명합니다.
장벽 무결성에 대한 산소-포도당 박탈(OGD)의 효과는 수동 투과성, 경내피 전기 저항(TEER) 측정 및 저산소 세포의 직접 시각화에 의해 평가되었습니다. 제시된 프로토콜은 생체 내에서 BBB의 세포 간 환경을 모방하는 뚜렷한 이점을 제공하여 허혈성 뇌 손상 설정에서 새로운 치료 전략을 개발하기 위한 보다 현실적인 시험관 내 BBB 모델로서 작용합니다.
Introduction
뇌졸중은 전 세계적으로 사망 및 장기 장애의 주요 원인 중 하나입니다1. 뇌졸중 발병률은 나이가 들면서 급격히 증가하여 55 세 이후 10 년마다 두 배로 증가합니다2. 허혈성 뇌졸중은 혈전 및 색전성 사건으로 인한 뇌 혈류 장애의 결과로 발생하며, 이는 모든 뇌졸중 사례의 80 % 이상을 포함합니다3. 지금도 허혈성 뇌졸중 후 조직 사망을 최소화 할 수있는 치료 옵션은 상대적으로 적습니다. 존재하는 치료법은 시간에 민감하며 결과적으로 항상 좋은 임상 결과로 이어지는 것은 아닙니다. 따라서 뇌졸중 후 회복에 영향을 미치는 허혈성 뇌졸중의 복잡한 세포 메커니즘에 대한 연구가 시급합니다.
BBB는 혈액과 뇌 실질 사이의 분자 교환을위한 동적 인터페이스입니다. 구조적으로, BBB는 기저막, 혈관주위세포, 및 성상세포 말단발4에 의해 둘러싸인 접합 복합체에 의해 상호 연결된 뇌 미세혈관 내피 세포로 구성된다. Pericytes 및 성상 세포는 강하고 단단한 접합부 5,6의 형성에 필요한 다양한 인자의 분비를 통해 BBB 무결성 유지에 필수적인 역할을합니다. BBB의 고장은 허혈성 뇌졸중의 특징 중 하나입니다. 뇌 허혈과 관련된 급성 염증 반응 및 산화 스트레스는 성상 세포, 혈관주위세포 및 내피 세포 사이의 단단한 접합 단백질 복합체 및 조절 장애 누화의 파괴를 초래하여 BBB7에 걸쳐 부세포 용질 투과성을 증가시킵니다. BBB 기능 장애는 뇌부종의 형성을 촉진하고 출혈성 변형의 위험을 증가시킵니다8. 위의 모든 것을 고려할 때, 허혈성 뇌졸중 중 및 후에 BBB 수준에서 발생하는 분자 및 세포 변화를 이해하는 데 큰 관심이 있습니다.
많은 시험관 내 BBB 모델이 최근 수십 년 동안 개발되어 다양한 연구에 사용되었지만 그 중 어느 것도 생체 내 조건을 완전히 복제 할 수 없습니다9. 일부 모델은 잘 삽입된 투과성 지지체에서 단독으로 또는 혈관주위세포 또는 성상세포와 함께 배양된 내피 세포 단층을 기반으로 하지만, 보다 최근의 연구에서만 삼중 세포 배양 모델 설계를 도입했습니다. 거의 모든 기존 삼중 배양 BBB 모델은 동물 종으로부터 단리된 성상세포 및 혈관주위세포 또는 인간 만능 줄기 세포10,11,12,13으로부터 유래된 세포와 함께 일차 뇌 내피 세포를 통합한다.
인간 BBB를 시험관 내에서 더 잘 요약할 필요성을 인식하고, 인간 뇌 미세혈관 내피 세포(HBMEC), 일차 인간 성상교세포(HA) 및 일차 인간 뇌 혈관 혈관주위세포(HBVP)로 구성된 삼중 세포 배양 시험 관 내 BBB 모델을 확립했습니다. 이 삼중 배양 BBB 모델은 0.4μm 공극 크기의 6웰 플레이트, 폴리에스테르 멤브레인 삽입물에 설정됩니다. 이 웰 인서트는 세포 부착을 위한 최적의 환경을 제공하며 중간 샘플링 또는 복합 적용을 위해 정점(혈액) 및 기저측(뇌) 구획 모두에 쉽게 접근할 수 있도록 합니다. 이 제안된 삼중 세포 배양 BBB 모델의 특징은 시험 관 내에서 허혈성 뇌졸중을 모방한 TEER 및 역세포 플럭스를 측정하여 평가되며, 가습되고 밀봉된 챔버를 사용하여 달성된 산소(<1%O2) 및 영양소(무포도당 배지 사용)의 부족이 있습니다. 또한, 이 모델에서 유도된 허혈성 유사 조건은 저산소 세포의 직접적인 시각화에 의해 정확하게 검증된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에서, 우리는 시험관 내 허혈성 뇌졸중의 설정에서 BBB 기능 장애를 연구하기 위한 신뢰할 수 있는 삼중 내피 세포-pericyte-성상세포 배양 BBB 모델을 설정하는 방법을 설명합니다. 혈관주위세포가 생체내에서 내피 세포의 가장 가까운 이웃이라는 것을 고려 하면, HBVP는 이 모델16에서 웰 삽입물의 밑면에 도금된다. 이러한 구성은 성상 세포와 내피 세포 사?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 국립 보건원 (NIH) 보조금 MH128022, MH122235, MH072567, MH122235, HL126559, DA044579, DA039576, DA040537, DA050528 및 DA047157의 지원을 받았습니다.
Materials
| 24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert | Corning | 3450 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Life Sciences (FISHERSCI) | P35GC-1.5-14-C | |
| Astrocyte Medium | Science Cell | 1801 | |
| Attachment Factor | Cell Systems (Fisher Scientific) | 4Z0-201 | |
| BD 60 mL Syringe | BD | 309653 | |
| BrainPhys Imaging Optimized Medium | STEMCELL Technologies | 5791 | |
| Complete Classic Medium With Serum and CultureBoost | 4Z0-500 | Cell Systems | |
| Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes (Conical Bottom with CentriStar Cap | VWR | 430829 | |
| Corning 75cm² U-Shaped Canted Neck Not Treated Cell Culture Flask | Corning | 431464U | |
| Corning CellBIND 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates | Corning | 3340 | |
| Countes Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | ZGEXSCCOUNTESS2FL | |
| Decon CiDehol 70 Isopropyl Alcohol Solution | Fisher Scientific | 04-355-71 | |
| Disposable Petri Dishes | VWR | 25384-088 | |
| DMEM Medium (No glucose, No glutamine, No phenol red) | ThermoFisher | A14430-01 | Glucose-free medium |
| DPBS (No Calcium, No Magnesium) | ThermoFisher | 14190250 | |
| EBM Endothelial Cell Growth Basal Medium, Phenol Red Free, 500 mL | Lonza | CC-3129 | |
| EVOM2 Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter with STX2 electrodes | World Precison Instruments | NC9792051 | Epithelial voltohmmeter |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 20,000) | Millipore Sigma | FD20-250MG | |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 70,000) | Millipore Sigma | FD70S-250MG | |
| Fluorview FV3000 Confocal Microscope | Olympus | FV3000 | |
| Gas Tank (95% N2, 5% CO2) | Airgas | X02NI95C2003071 | |
| HBSS (No calcium, No magnesium, no phenol red) | Thermofisher | 14025092 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate – 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | |
| Human Astrocytes | Science Cell | 1800 | |
| Human Brain Vascular Pericytes | Science Cell | 1200 | |
| Hypoxia Incubator Chamber | STEMCELL Technologies | 27310 | |
| Image-iT Green Hypoxia Reagent | ThermoFisher | I14834 | |
| Pericyte Medium | Science Cell | 1201 | |
| Primary Human Brain Microvascular Endothelial Cells | ACBRI 376 | Cell Systems | |
| Rocking Platform Shaker, Double | VWR | 10860-658 | |
| Single Flow Meter | STEMCELL Technologies | 27311 | |
| SpectraMax iD3 Microplate Reader | Molecular Devices | 75886-128 | |
| Syringe Filter, 25 mm, 0.22 μm, PVDF, Sterile | NEST Scientific | 380121 | |
| TPP Mutli-well Plates (6 wells) | MidSci | TP92406 | |
| TPP Tissue Culture Flasks T-75 Flasks | MidSci | TP90075 | Flasks with activated surface for cell adhesion |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher | 25200056 | |
| UltraPure Distilled Water | Invitrogen (Life Technologies) | 10977-015 | |
| Uno Stage Top Incubator- | Oko Lab | UNO-T-H-CO2-TTL |
Referências
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