Un modelo triple de cultivo celular primario de la barrera hematoencefálica humana para estudiar el accidente cerebrovascular isquémico in vitro
Summary
Aquí, describimos el método para establecer un modelo de cultivo celular triple de la barrera hematoencefálica basado en células endoteliales microvasculares primarias del cerebro humano, astrocitos y pericitos. Este modelo multicelular es adecuado para estudios de disfunción de unidades neurovasculares durante el ictus isquémico in vitro o para el cribado de candidatos a fármacos.
Abstract
El accidente cerebrovascular isquémico es una causa importante de muerte y discapacidad en todo el mundo con opciones terapéuticas limitadas. La neuropatología del accidente cerebrovascular isquémico se caracteriza por una interrupción en el suministro de sangre al cerebro que conduce a la muerte celular y la disfunción cognitiva. Durante y después del accidente cerebrovascular isquémico, la disfunción de la barrera hematoencefálica (BHE) facilita la progresión de la lesión y contribuye a una recuperación deficiente del paciente. Los modelos actuales de BBB incluyen principalmente monocultivos endoteliales y cocultivos dobles con astrocitos o pericitos.
Tales modelos carecen de la capacidad de imitar completamente un microambiente cerebral dinámico, que es esencial para la comunicación de célula a célula. Además, los modelos de BBB comúnmente utilizados a menudo contienen células endoteliales humanas inmortalizadas o cultivos celulares derivados de animales (roedores, porcinos o bovinos) que plantean limitaciones de traducción. Este artículo describe un nuevo modelo de BBB basado en bien insertados que contiene solo células humanas primarias (células endoteliales microvasculares cerebrales, astrocitos y pericitos vasculares cerebrales) que permite la investigación de la lesión cerebral isquémica in vitro.
Los efectos de la privación de oxígeno-glucosa (OGD) sobre la integridad de la barrera se evaluaron mediante mediciones de permeabilidad pasiva, resistencia eléctrica transendotelial (TEER) y visualización directa de células hipóxicas. El protocolo presentado ofrece una clara ventaja al imitar el entorno intercelular de la BHE in vivo, sirviendo como un modelo de BHE in vitro más realista para desarrollar nuevas estrategias terapéuticas en el contexto de la lesión cerebral isquémica.
Introduction
El accidente cerebrovascular es una de las principales causas de muerte y discapacidad a largo plazo en todo el mundo1. La incidencia de accidente cerebrovascular aumenta rápidamente con la edad, duplicándose cada 10 años después de los 55 años2. El accidente cerebrovascular isquémico ocurre como resultado de la interrupción del flujo sanguíneo cerebral debido a eventos trombóticos y embólicos, que abarca más del 80% de todos los casos de accidente cerebrovascular3. Incluso ahora, hay relativamente pocas opciones de tratamiento disponibles para minimizar la muerte del tejido después de un accidente cerebrovascular isquémico. Los tratamientos que existen son sensibles al tiempo y, en consecuencia, no siempre conducen a buenos resultados clínicos. Por lo tanto, se necesita urgentemente investigación sobre los mecanismos celulares complejos del accidente cerebrovascular isquémico que afectan la recuperación posterior al accidente cerebrovascular.
La barrera hematoencefálica es una interfaz dinámica para el intercambio de moléculas entre la sangre y el parénquima cerebral. Estructuralmente, la BHE está compuesta por células endoteliales microvasculares cerebrales interconectadas por complejos de unión rodeados por una membrana basal, pericitos y patas terminales astrocíticas4. Los pericitos y astrocitos juegan un papel esencial en el mantenimiento de la integridad de la barrera hematoencefálica a través de la secreción de diversos factores necesarios para la formación de uniones fuertes y estrechas 5,6. La ruptura de la barrera hematoencefálica es una de las características distintivas del accidente cerebrovascular isquémico. La respuesta inflamatoria aguda y el estrés oxidativo asociado con la isquemia cerebral dan como resultado la interrupción de los complejos de proteínas de unión estrecha y la diafonía desregulada entre astrocitos, pericitos y células endoteliales, lo que conduce a una mayor permeabilidad al soluto paracelular a través de la barrera hematoencefálica7. La disfunción BBB promueve aún más la formación de edema cerebral y aumenta el riesgo de transformación hemorrágica8. Teniendo en cuenta todo lo anterior, existe un gran interés en comprender los cambios moleculares y celulares que ocurren a nivel de BBB durante y después del accidente cerebrovascular isquémico.
Aunque muchos modelos de BBB in vitro han sido desarrollados en las últimas décadas y utilizados en una variedad de estudios, ninguno de ellos puede replicar completamente las condiciones in vivo 9. Si bien algunos modelos se basan en monocapas de células endoteliales cultivadas en soportes permeables bien insertados solos o en combinación con pericitos o astrocitos, solo estudios más recientes han introducido diseños de modelos de cultivo celular triple. Casi todos los modelos existentes de triple cultivo de BBB incorporan células endoteliales cerebrales primarias junto con astrocitos y pericitos aislados de especies animales o células derivadas de células madre pluripotentes humanas10,11,12,13.
Reconociendo la necesidad de recapitular mejor la BHE humana in vitro, establecimos un modelo de triple cultivo celular in vitro BBB compuesto por células endoteliales microvasculares del cerebro humano (HBMEC), astrocitos humanos primarios (HA) y pericitos vasculares cerebrales humanos primarios (HBVP). Este modelo BBB de triple cultivo se configura en placas de 6 pocillos, insertos de membrana de poliéster con un tamaño de poro de 0,4 μm. Estos insertos de pozo proporcionan un entorno óptimo para la unión celular y permiten un fácil acceso a los compartimentos apical (sangre) y basolateral (cerebro) para el muestreo del medio o la aplicación de compuestos. Las características de este modelo propuesto de BBB de cultivo triple celular se evalúan midiendo TEER y flujo paracelular después de OGD imitando el accidente cerebrovascular isquémico in vitro, con una escasez de oxígeno (<1%O2) y nutrientes (mediante el uso de medio libre de glucosa) lograda mediante el uso de una cámara humidificada y sellada. Además, las condiciones isquémicas inducidas en este modelo se verifican con precisión mediante la visualización directa de células hipóxicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este protocolo, describimos un método para establecer un modelo fiable de cultivo de BBB triple de células endoteliales-pericito-astrocitos para estudiar la disfunción de la BHE en el contexto de un accidente cerebrovascular isquémico in vitro. Teniendo en cuenta que los pericitos son los vecinos más cercanos de las células endoteliales in vivo, el HBVP está plateado en la parte inferior de los insertos de pocillos en este modelo16. Aunque esta configuración carece de …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones MH128022, MH122235, MH072567, MH122235, HL126559, DA044579, DA039576, DA040537, DA050528 y DA047157.
Materials
| 24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert | Corning | 3450 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Life Sciences (FISHERSCI) | P35GC-1.5-14-C | |
| Astrocyte Medium | Science Cell | 1801 | |
| Attachment Factor | Cell Systems (Fisher Scientific) | 4Z0-201 | |
| BD 60 mL Syringe | BD | 309653 | |
| BrainPhys Imaging Optimized Medium | STEMCELL Technologies | 5791 | |
| Complete Classic Medium With Serum and CultureBoost | 4Z0-500 | Cell Systems | |
| Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes (Conical Bottom with CentriStar Cap | VWR | 430829 | |
| Corning 75cm² U-Shaped Canted Neck Not Treated Cell Culture Flask | Corning | 431464U | |
| Corning CellBIND 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates | Corning | 3340 | |
| Countes Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | ZGEXSCCOUNTESS2FL | |
| Decon CiDehol 70 Isopropyl Alcohol Solution | Fisher Scientific | 04-355-71 | |
| Disposable Petri Dishes | VWR | 25384-088 | |
| DMEM Medium (No glucose, No glutamine, No phenol red) | ThermoFisher | A14430-01 | Glucose-free medium |
| DPBS (No Calcium, No Magnesium) | ThermoFisher | 14190250 | |
| EBM Endothelial Cell Growth Basal Medium, Phenol Red Free, 500 mL | Lonza | CC-3129 | |
| EVOM2 Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter with STX2 electrodes | World Precison Instruments | NC9792051 | Epithelial voltohmmeter |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 20,000) | Millipore Sigma | FD20-250MG | |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 70,000) | Millipore Sigma | FD70S-250MG | |
| Fluorview FV3000 Confocal Microscope | Olympus | FV3000 | |
| Gas Tank (95% N2, 5% CO2) | Airgas | X02NI95C2003071 | |
| HBSS (No calcium, No magnesium, no phenol red) | Thermofisher | 14025092 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate – 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | |
| Human Astrocytes | Science Cell | 1800 | |
| Human Brain Vascular Pericytes | Science Cell | 1200 | |
| Hypoxia Incubator Chamber | STEMCELL Technologies | 27310 | |
| Image-iT Green Hypoxia Reagent | ThermoFisher | I14834 | |
| Pericyte Medium | Science Cell | 1201 | |
| Primary Human Brain Microvascular Endothelial Cells | ACBRI 376 | Cell Systems | |
| Rocking Platform Shaker, Double | VWR | 10860-658 | |
| Single Flow Meter | STEMCELL Technologies | 27311 | |
| SpectraMax iD3 Microplate Reader | Molecular Devices | 75886-128 | |
| Syringe Filter, 25 mm, 0.22 μm, PVDF, Sterile | NEST Scientific | 380121 | |
| TPP Mutli-well Plates (6 wells) | MidSci | TP92406 | |
| TPP Tissue Culture Flasks T-75 Flasks | MidSci | TP90075 | Flasks with activated surface for cell adhesion |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher | 25200056 | |
| UltraPure Distilled Water | Invitrogen (Life Technologies) | 10977-015 | |
| Uno Stage Top Incubator- | Oko Lab | UNO-T-H-CO2-TTL |
Referências
- Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics-2016 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 133 (94), 38 (2016).
- Yousufuddin, M., Young, N. Aging and ischemic stroke. Aging. 11 (9), 2542-2544 (2019).
- Donkor, E. S. Stroke in the 21st century: a snapshot of the burden, epidemiology, and quality of life. Stroke Research and Treatment. , 3238165 (2018).
- Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity. Fluids and Barriers of the CNS. 17 (1), 69 (2020).
- Brown, L. S., et al. Pericytes and neurovascular function in the healthy and diseased brain. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 282 (2019).
- Cabezas, R., et al. Astrocytic modulation of blood brain barrier: perspectives on Parkinson’s disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 211 (2014).
- Abdullahi, W., Tripathi, D., Ronaldson, P. T. Blood-brain barrier dysfunction in ischemic stroke: targeting tight junctions and transporters for vascular protection. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 315 (3), 343-356 (2018).
- Candelario-Jalil, E., Dijkhuizen, R. M., Magnus, T. Neuroinflammation, stroke, blood-brain barrier dysfunction, and imaging modalities. Stroke. 53 (5), 1473-1486 (2022).
- He, Y., Yao, Y., Tsirka, S. E., Cao, Y. Cell-culture models of the blood-brain barrier. Stroke. 45 (8), 2514-2526 (2014).
- Thomsen, L. B., Burkhart, A., Moos, T. A triple culture model of the blood-brain barrier using porcine brain endothelial cells, astrocytes and pericytes. PLoS One. 10 (8), 0134765 (2015).
- Song, Y., Cai, X., Du, D., Dutta, P., Lin, Y. Comparison of blood-brain barrier models for in vitro biological analysis: one cell type vs three cell types. ACS Applied Bio Materials. 2 (3), 1050-1055 (2019).
- Xu, L., et al. Silver nanoparticles induce tight junction disruption and astrocyte neurotoxicity in a rat blood-brain barrier primary triple coculture model. International Journal of Nanomedicine. 10, 6105-6118 (2015).
- Appelt-Menzel, A. Establishment of a human blood-brain barrier co-culture model mimicking the neurovascular unit using induced pluri- and multipotent stem cells. Stem Cell Reports. 8 (4), 894-906 (2017).
- Zhang, Y., et al. Rational construction of a reversible arylazo-based NIR probe for cycling hypoxia imaging in vivo. Nature Communications. 12 (1), 2772 (2021).
- Palacio-Castañeda, V., Kooijman, L., Venzac, B., Verdurmen, W. P. R., Le Gac, S. Metabolic switching of tumor cells under hypoxic conditions in a tumor-on-a-chip model. Micromachines. 11 (4), 382 (2020).
- Ramsauer, M., Krause, D., Dermietzel, R. Angiogenesis of the blood-brain barrier in vitro and the function of cerebral pericytes. FASEB Journal. 16 (10), 1274-1276 (2002).
- Lyck, R., et al. ALCAM (CD166) is involved in extravasation of monocytes rather than T cells across the blood-brain barrier. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37 (8), 2894-2909 (2017).
- Rizzi, E., et al. A triple culture cell system modeling the human blood-brain barrier. Journal of Visualized Experiments. (177), (2021).
- Kumar, S., Shaw, L., Lawrence, C., Lea, R., Alder, J. P50: Developing a physiologically relevant blood brain barrier model for the study of drug disposition in glioma. Neuro-Oncology. 16 (6), (2014).
- Stone, N. L., England, T. J., O’Sullivan, S. E. A novel transwell blood brain barrier model using primary human cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 230 (2019).
- Al Ahmad, A., Taboada, C. B., Gassmann, M., Ogunshola, O. O. Astrocytes and pericytes differentially modulate blood-brain barrier characteristics during development and hypoxic insult. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 31 (2), 693-705 (2011).
