En trippel primär cellodlingsmodell av den mänskliga blod-hjärnbarriären för att studera ischemisk stroke in vitro
Summary
Här beskriver vi metoden för att etablera en trippelcellsodlingsmodell av blod-hjärnbarriären baserad på primära mänskliga hjärnmikrovaskulära endotelceller, astrocyter och pericyter. Denna flercelliga modell är lämplig för studier av neurovaskulär enhetsdysfunktion under ischemisk stroke in vitro eller för screening av läkemedelskandidater.
Abstract
Ischemisk stroke är en viktig orsak till dödsfall och funktionshinder över hela världen med begränsade terapeutiska alternativ. Neuropatologin för ischemisk stroke kännetecknas av ett avbrott i blodtillförseln till hjärnan som leder till celldöd och kognitiv dysfunktion. Under och efter ischemisk stroke underlättar dysfunktion i blod-hjärnbarriären (BBB) skadeprogression och bidrar till dålig patientåterhämtning. Nuvarande BBB-modeller inkluderar främst endotelmonokulturer och dubbla samkulturer med antingen astrocyter eller pericyter.
Sådana modeller saknar förmågan att fullt ut imitera en dynamisk hjärnmikromiljö, vilket är viktigt för cell-till-cell-kommunikation. Dessutom innehåller vanliga BBB-modeller ofta odödliga mänskliga endotelceller eller djur-härledda (gnagare, svin eller nötkreatur) cellkulturer som utgör translationella begränsningar. Denna artikel beskriver en ny välinsättningsbaserad BBB-modell som endast innehåller primära mänskliga celler (hjärnmikrovaskulära endotelceller, astrocyter och hjärnvaskulära pericyter) som möjliggör undersökning av ischemisk hjärnskada in vitro.
Effekterna av syre-glukosbrist (OGD) på barriärintegritet bedömdes genom passiv permeabilitet, transendotelial elektrisk resistans (TEER) -mätningar och direkt visualisering av hypoxiska celler. Det presenterade protokollet erbjuder en tydlig fördel som efterliknar den intercellulära miljön hos BBB in vivo, vilket fungerar som en mer realistisk de vitro BBB-modell för att utveckla nya terapeutiska strategier vid inställning av ischemisk hjärnskada.
Introduction
Stroke är en av de främsta orsakerna till dödsfall och långvarig funktionsnedsättning över hela världen1. Förekomsten av stroke ökar snabbt med åldern och fördubblas var 10: e år efter 55års ålder 2. Ischemisk stroke uppstår som ett resultat av cerebral blodflödesstörning på grund av trombotiska och emboliska händelser, som omfattar mer än 80% av alla strokefall3. Även nu finns det relativt få behandlingsalternativ tillgängliga för att minimera vävnadsdöd efter ischemisk stroke. De behandlingar som finns är tidskänsliga och leder därför inte alltid till goda kliniska resultat. Därför behövs forskning om komplexa cellulära mekanismer för ischemisk stroke som påverkar återhämtning efter stroke.
BBB är ett dynamiskt gränssnitt för utbyte av molekyler mellan blodet och hjärnans parenkym. Strukturellt består BBB av hjärnans mikrovaskulära endotelceller sammankopplade av korsningskomplex omgivna av ett källarmembran, pericyter och astrocytiska endfeet4. Pericyter och astrocyter spelar en viktig roll i upprätthållandet av BBB-integritet genom utsöndring av olika faktorer som är nödvändiga för bildandet av starka, täta korsningar 5,6. Nedbrytningen av BBB är ett av kännetecknen för ischemisk stroke. Akut inflammatoriskt svar och oxidativ stress i samband med cerebral ischemi resulterar i störningar av proteinkomplex med tät korsning och dysreglerad överhörning mellan astrocyter, pericyter och endotelceller, vilket leder till ökad paracellulär löst permeabilitet över BBB7. BBB-dysfunktion främjar ytterligare bildandet av hjärnödem och ökar risken för hemorragisk transformation8. Med tanke på allt ovanstående finns det stort intresse för att förstå de molekylära och cellulära förändringar som uppstår på BBB-nivå under och efter ischemisk stroke.
Även om många in vitro BBB-modeller har utvecklats under de senaste decennierna och använts i en mängd olika studier, kan ingen av dem helt replikera in vivo-förhållanden 9. Medan vissa modeller är baserade på endotelcellmonolager odlade på välplacerade permeabla stöd ensamma eller i kombination med pericyter eller astrocyter, har endast nyare studier introducerat trippelcellodlingsmodelldesigner. Nästan alla befintliga trippelodlings-BBB-modeller innehåller primära hjärnendotelceller tillsammans med astrocyter och pericyter isolerade från djurarter eller celler som härrör från mänskliga pluripotenta stamceller10,11,12,13.
Genom att erkänna behovet av att bättre rekapitulera den mänskliga BBB in vitro, etablerade vi en trippelcellodling in vitro BBB-modell bestående av mänskliga hjärnmikrovaskulära endotelceller (HBMEC), primära mänskliga astrocyter (HA) och primära humana hjärnvaskulära pericyter (HBVP). Denna trippelkultur BBB-modell är inställd på 6-brunnsplatta, polyestermembraninsatser med 0,4 μm porstorlek. Dessa brunnsinsatser ger en optimal miljö för cellfästning och möjliggör enkel åtkomst till både apikala (blod) och basolaterala (hjärn) fack för medium provtagning eller föreningsapplikation. Egenskaperna hos denna föreslagna trippelcellodlings-BBB-modell bedöms genom att mäta TEER och paracellulärt flöde efter OGD som efterliknar ischemisk stroke in vitro, med brist på syre (<1%O2) och näringsämnen (genom att använda glukosfritt medium) som uppnås genom att använda en fuktad, förseglad kammare. Dessutom verifieras inducerade ischemiska liknande förhållanden i denna modell exakt genom direkt visualisering av hypoxiska celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta protokoll beskriver vi en metod för att sätta upp en tillförlitlig trippel endotelcell-pericyt-astrocytkultur BBB-modell för att studera BBB-dysfunktion vid inställning av ischemisk stroke in vitro. Med tanke på att pericyter är närmaste grannar till endotelceller in vivo, är HBVP pläterade på undersidan av brunnsinsatserna i denna modell16. Även om denna konfiguration saknar den direkta cell-till-cell-kommunikationen mellan astrocyter och endotelceller, möjl…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NIH) bidrag MH128022, MH122235, MH072567, MH122235, HL126559, DA044579, DA039576, DA040537, DA050528 och DA047157.
Materials
| 24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert | Corning | 3450 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Life Sciences (FISHERSCI) | P35GC-1.5-14-C | |
| Astrocyte Medium | Science Cell | 1801 | |
| Attachment Factor | Cell Systems (Fisher Scientific) | 4Z0-201 | |
| BD 60 mL Syringe | BD | 309653 | |
| BrainPhys Imaging Optimized Medium | STEMCELL Technologies | 5791 | |
| Complete Classic Medium With Serum and CultureBoost | 4Z0-500 | Cell Systems | |
| Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes (Conical Bottom with CentriStar Cap | VWR | 430829 | |
| Corning 75cm² U-Shaped Canted Neck Not Treated Cell Culture Flask | Corning | 431464U | |
| Corning CellBIND 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates | Corning | 3340 | |
| Countes Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | ZGEXSCCOUNTESS2FL | |
| Decon CiDehol 70 Isopropyl Alcohol Solution | Fisher Scientific | 04-355-71 | |
| Disposable Petri Dishes | VWR | 25384-088 | |
| DMEM Medium (No glucose, No glutamine, No phenol red) | ThermoFisher | A14430-01 | Glucose-free medium |
| DPBS (No Calcium, No Magnesium) | ThermoFisher | 14190250 | |
| EBM Endothelial Cell Growth Basal Medium, Phenol Red Free, 500 mL | Lonza | CC-3129 | |
| EVOM2 Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter with STX2 electrodes | World Precison Instruments | NC9792051 | Epithelial voltohmmeter |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 20,000) | Millipore Sigma | FD20-250MG | |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 70,000) | Millipore Sigma | FD70S-250MG | |
| Fluorview FV3000 Confocal Microscope | Olympus | FV3000 | |
| Gas Tank (95% N2, 5% CO2) | Airgas | X02NI95C2003071 | |
| HBSS (No calcium, No magnesium, no phenol red) | Thermofisher | 14025092 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate – 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | |
| Human Astrocytes | Science Cell | 1800 | |
| Human Brain Vascular Pericytes | Science Cell | 1200 | |
| Hypoxia Incubator Chamber | STEMCELL Technologies | 27310 | |
| Image-iT Green Hypoxia Reagent | ThermoFisher | I14834 | |
| Pericyte Medium | Science Cell | 1201 | |
| Primary Human Brain Microvascular Endothelial Cells | ACBRI 376 | Cell Systems | |
| Rocking Platform Shaker, Double | VWR | 10860-658 | |
| Single Flow Meter | STEMCELL Technologies | 27311 | |
| SpectraMax iD3 Microplate Reader | Molecular Devices | 75886-128 | |
| Syringe Filter, 25 mm, 0.22 μm, PVDF, Sterile | NEST Scientific | 380121 | |
| TPP Mutli-well Plates (6 wells) | MidSci | TP92406 | |
| TPP Tissue Culture Flasks T-75 Flasks | MidSci | TP90075 | Flasks with activated surface for cell adhesion |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher | 25200056 | |
| UltraPure Distilled Water | Invitrogen (Life Technologies) | 10977-015 | |
| Uno Stage Top Incubator- | Oko Lab | UNO-T-H-CO2-TTL |
Referências
- Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics-2016 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 133 (94), 38 (2016).
- Yousufuddin, M., Young, N. Aging and ischemic stroke. Aging. 11 (9), 2542-2544 (2019).
- Donkor, E. S. Stroke in the 21st century: a snapshot of the burden, epidemiology, and quality of life. Stroke Research and Treatment. , 3238165 (2018).
- Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity. Fluids and Barriers of the CNS. 17 (1), 69 (2020).
- Brown, L. S., et al. Pericytes and neurovascular function in the healthy and diseased brain. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 282 (2019).
- Cabezas, R., et al. Astrocytic modulation of blood brain barrier: perspectives on Parkinson’s disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 211 (2014).
- Abdullahi, W., Tripathi, D., Ronaldson, P. T. Blood-brain barrier dysfunction in ischemic stroke: targeting tight junctions and transporters for vascular protection. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 315 (3), 343-356 (2018).
- Candelario-Jalil, E., Dijkhuizen, R. M., Magnus, T. Neuroinflammation, stroke, blood-brain barrier dysfunction, and imaging modalities. Stroke. 53 (5), 1473-1486 (2022).
- He, Y., Yao, Y., Tsirka, S. E., Cao, Y. Cell-culture models of the blood-brain barrier. Stroke. 45 (8), 2514-2526 (2014).
- Thomsen, L. B., Burkhart, A., Moos, T. A triple culture model of the blood-brain barrier using porcine brain endothelial cells, astrocytes and pericytes. PLoS One. 10 (8), 0134765 (2015).
- Song, Y., Cai, X., Du, D., Dutta, P., Lin, Y. Comparison of blood-brain barrier models for in vitro biological analysis: one cell type vs three cell types. ACS Applied Bio Materials. 2 (3), 1050-1055 (2019).
- Xu, L., et al. Silver nanoparticles induce tight junction disruption and astrocyte neurotoxicity in a rat blood-brain barrier primary triple coculture model. International Journal of Nanomedicine. 10, 6105-6118 (2015).
- Appelt-Menzel, A. Establishment of a human blood-brain barrier co-culture model mimicking the neurovascular unit using induced pluri- and multipotent stem cells. Stem Cell Reports. 8 (4), 894-906 (2017).
- Zhang, Y., et al. Rational construction of a reversible arylazo-based NIR probe for cycling hypoxia imaging in vivo. Nature Communications. 12 (1), 2772 (2021).
- Palacio-Castañeda, V., Kooijman, L., Venzac, B., Verdurmen, W. P. R., Le Gac, S. Metabolic switching of tumor cells under hypoxic conditions in a tumor-on-a-chip model. Micromachines. 11 (4), 382 (2020).
- Ramsauer, M., Krause, D., Dermietzel, R. Angiogenesis of the blood-brain barrier in vitro and the function of cerebral pericytes. FASEB Journal. 16 (10), 1274-1276 (2002).
- Lyck, R., et al. ALCAM (CD166) is involved in extravasation of monocytes rather than T cells across the blood-brain barrier. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37 (8), 2894-2909 (2017).
- Rizzi, E., et al. A triple culture cell system modeling the human blood-brain barrier. Journal of Visualized Experiments. (177), (2021).
- Kumar, S., Shaw, L., Lawrence, C., Lea, R., Alder, J. P50: Developing a physiologically relevant blood brain barrier model for the study of drug disposition in glioma. Neuro-Oncology. 16 (6), (2014).
- Stone, N. L., England, T. J., O’Sullivan, S. E. A novel transwell blood brain barrier model using primary human cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 230 (2019).
- Al Ahmad, A., Taboada, C. B., Gassmann, M., Ogunshola, O. O. Astrocytes and pericytes differentially modulate blood-brain barrier characteristics during development and hypoxic insult. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 31 (2), 693-705 (2011).
