Sekresjonen av rotekssudater er vanligvis en ekstern avgiftningsstrategi for planter under stressforhold. Denne protokollen beskriver hvordan man vurderer virkningen av xenobiotika på alfalfa via ikke-målrettet metabolomisk analyse.
Rotekssudater er hovedmediet for informasjonskommunikasjon og energioverføring mellom planterøtter og omgivelsene. Endringen i sekresjon av rotekssudater er vanligvis en ekstern avgiftningsstrategi for planter under stressforhold. Denne protokollen tar sikte på å introdusere generelle retningslinjer for innsamling av alfalfarotekssudater for å studere virkningen av di (2-etylheksyl) ftalat (DEHP) på metabolittproduksjon. For det første dyrkes alfalfaplanter under DEHP-stress i et hydroponisk kultureksperiment. For det andre overføres plantene til sentrifugerør som inneholder 50 ml sterilisert ultrarent vann i 6 timer for å samle rotekssudater. Løsningene frysetørkes deretter i en vakuumfrysetørker. De frosne prøvene ekstraheres og derivatiseres med bis(trimetylsilyl)) trifluoracetamid (BSTFA) reagens. Deretter måles de derivatiserte ekstraktene ved hjelp av et gasskromatografsystem kombinert med et time-of-flight massespektrometer (GC-TOF-MS). De ervervede metabolittdataene analyseres deretter basert på bioinformatiske metoder. Differensialmetabolitter og signifikant endrede metabolismeveier bør undersøkes dypt for å avsløre virkningen av DEHP på alfalfa i lys av rotekssudater.
Di (2-etylheksyl) ftalat (DEHP) er en syntetisk kjemisk forbindelse som er mye brukt i forskjellige plast og polymerer som mykner for å forbedre plastisiteten og styrken. I løpet av de siste årene har et økende antall studier antydet at DEHP er hormonforstyrrende og har negativ effekt på respiratoriske, nervøse og reproduktive systemer hos mennesker og andre dyr 1,2,3. Med tanke på helserisikoen har USAs miljøvernbyrå, EU og Environmental Monitoring Center of China alle klassifisert DEHP i listen over prioriterte forurensende stoffer. Jord har blitt ansett som en viktig vask av DEHP i miljøet, på grunn av påføring av plastmulching og organisk gjødsel, vanning med avløpsvann og slambruk4. Som forventet har DEHP blitt allestedsnærværende oppdaget i jordbruksjord, hvis innhold til og med når opp til milligram per kilo tørket jord i noen regioner i Kina 5,6. DEHP kan gå inn i planter hovedsakelig via røttene og gjennomgå biomagnifisering på forskjellige trofiske nivåer i jordøkosystemer7. Derfor har det blitt reist betydelig bekymring for DEHP-indusert stress i planter de siste tiårene.
Planter er vanligvis sårbare for DEHP-eksponering. DEHP-stress har blitt observert å utøve en negativ effekt på frøspredning og normal metabolisme, og dermed hemme plantevekst og utvikling 8,9. For eksempel kan DEHP indusere oksidativ skade på mesofyllceller, redusere innholdet av klorofyll og osmolytter, og heve antioksidative enzymaktiviteter, noe som til slutt resulterer i en nedgang i utbyttet og kvaliteten på spiselige planter10,11. Imidlertid har de fleste av de tidligere studiene på planters respons på DEHP-stress fokusert på oksidativt stress og fysiologiske og biokjemiske egenskaper. De tilsvarende mekanismene forbundet med plantemetabolisme er mindre studert. Rotekssudater er et generisk begrep som beskriver forbindelser som planterøtter skiller ut og slipper ut i miljøet. De har blitt betraktet som interaksjonsmediet mellom planter og jord i rhizosfæren, og spiller en viktig rolle i å støtte plantevekst og utvikling12. Det har vært velkjent at rotekssudater står for omtrent 30% -40% av alt fotosyntetisk karbon13. I forurensede miljøer er rotekssudater involvert i å forbedre plantens toleranse for stress av forurensende stoffer gjennom metabolisme eller ekstern ekskludering14. Som en konsekvens kan en dyp forståelse av responsen av planterot ekssudater til forurensningsstress bidra til å avsløre de underliggende mekanismene forbundet med cellebiokjemi og biologiske fenomener15.
Metabolomics-teknologi gir en effektiv strategi for å måle et stort antall småmolekylære metabolitter samtidig i celler 16,17, vev18, og til og med ekssudater av organismer 19, inkludert sukkerarter, organiske syrer, aminosyrer og lipider. Sammenlignet med tradisjonelle eller klassiske kjemiske analysemetoder, øker metabolomics-tilnærmingen i stor grad antall metabolitter som kan detekteres20, noe som kan bidra til å identifisere metabolitter på en høyere gjennomstrømningsmåte og identifisere viktige metabolske veier. Metabolomics har vært mye brukt i forskningsfeltet biologisk respons i stresmiljøer, som tungmetaller21, nye forurensninger22 og nanopartikler19. De fleste av disse studiene på planter har fokusert på metabolske endringer i indre plantevev, mens få har blitt rapportert om responsen av rotekssudater til miljøstress. Derfor er målet med denne studien å introdusere generelle retningslinjer for innsamling av alfalfarotekssudater for å studere virkningen av DEHP på metabolittproduksjon. Resultatene vil gi en metodeveiledning for DEHPs oppfølgingsstudie av plantemetabolomikk.
Denne protokollen gir generell veiledning om hvordan man samler inn og måler rotekssudatene av alfalfa under DEHP-stress, samt hvordan man analyserer metabolomdataene. Det må legges stor vekt på noen kritiske trinn i denne protokollen. I hydroponiske kultureksperimenter ble alfalfaplanter hydroponisk dyrket i glassflasker fylt med næringsoppløsninger med forskjellige konsentrasjoner av DEHP. Glassflaskene skal beskyttes mot lys ved å dekke dem med aluminiumsfolie gjennom hele kulturperioden, for å forhindre DEHP f…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet i fellesskap av National Natural Science Foundation of China (41877139), de store prosjektene til National Natural Science Foundation of China (41991335), National Key Research and Development Program of China (2016YFD0800204), Natural Science Foundation of Jiangsu-provinsen (nr. BK20161616), “135” -planen og grenseprogrammet til det kinesiske vitenskapsakademiet (ISSASIP1615).
Adonitol | SIGMA | ≥99% | |
Alfalfa seeds | Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (Nanjing, China) | ||
Analytical balance | Sartorius | BSA124S-CW | |
BSTFA | REGIS Technologies | with 1% TMCS, v/v | |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Fresco17 | |
Chromatographic column | Agilent | DB-5MS (30 m × 250 μm × 0.25 μm) | |
Di(2-ethylhexyl) phthalate | Dr. Ehrenstorfer | ||
FAMEs | Dr. Ehrenstorfer | ||
Gas chromatography(GC) | Agilent | 7890A | |
Grinding instrument | Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd | JXFSTPRP-24 | |
Mass spectrometer(MS) | LECO | PEGASUS HT | |
Methanol | CNW Technologies | HPLC | |
Methoxyaminatio hydrochloride | TCI | AR | |
Microcentrifuge tube | Eppendorf | Eppendorf Quality | 1.5 mL |
Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd | DHG-9023A | |
Pyridine | Adamas | HPLC | |
R software | statistical analysis software (pathway enrichment, topology) | ||
SIMCA16.0.2 | statistical analysis software (OPLS-DA etc) | ||
Ultra low temperature freezer | Thermo Fisher Scientific | Forma 900 series | |
Ultrasound | Shenzhen Fangao Microelectronics Co., Ltd | YM-080S | |
Vacuum dryer | Taicang Huamei biochemical instrument factory | LNG-T98 |