نماذج تقويم العظام متعدية للورم الأرومي الدبقي متعدد الأشكال
Summary
هنا ، نصف نموذج الفأر التقويمي قبل السريري ل GBM ، الذي تم إنشاؤه عن طريق الحقن داخل الجمجمة للخلايا المشتقة من أورام نموذج الفئران المعدلة وراثيا. يعرض هذا النموذج السمات المميزة لمرض GBM البشري. بالنسبة للدراسات الانتقالية ، يتم تتبع ورم دماغ الفأر عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي في الجسم الحي وعلم أمراض الأنسجة.
Abstract
تعد نماذج الفئران المعدلة وراثيا (GEM) للورم الأرومي الدبقي البشري متعدد الأشكال (GBM) ضرورية لفهم تطور أورام الدماغ وتطورها. على عكس أورام xenograft ، في GEMs ، تنشأ الأورام في البيئة المكروية الأصلية في فأر مناعي. ومع ذلك ، فإن استخدام GBM GEMs في دراسات العلاج قبل السريري يمثل تحديا بسبب زمن انتقال الورم الطويل ، وعدم التجانس في تردد الأورام ، وتوقيت تطور الورم من الدرجة المتقدمة. الفئران المستحثة عن طريق الحقن التقويمي داخل الجمجمة هي أكثر قابلية للتتبع للدراسات قبل السريرية ، وتحتفظ بسمات أورام GEM. لقد أنشأنا نموذجا لورم الدماغ التقويمي مشتقا من نموذج GEM مع انحرافات Rb و Kras و p53 (TRP) ، والتي تطور أورام GBM التي تعرض بؤرا خطية للنخر بواسطة الخلايا الورمية ، والأوعية الدموية الكثيفة المماثلة ل GBM البشري. يتم حقن الخلايا المشتقة من أورام GEM GBM داخل الجمجمة في الفئران المتلقية من النوع البري والمتطابقة مع الإجهاد وتكاثر أورام الدرجة الرابعة ، وبالتالي تجاوز فترة كمون الورم الطويلة في الفئران GEM والسماح بإنشاء مجموعات كبيرة وقابلة للتكرار للدراسات قبل السريرية. يتم تلخيص السمات التكاثرية للغاية والغازية والأوعية الدموية لنموذج TRP GEM ل GBM في أورام تقويم العظام ، وتعكس علامات التشريح المرضي مجموعات فرعية GBM البشرية. تتم مراقبة نمو الورم عن طريق فحوصات التصوير بالرنين المغناطيسي التسلسلية. نظرا للطبيعة الغازية للأورام داخل الجمجمة في النماذج ذات الكفاءة المناعية ، فإن اتباع إجراء الحقن الموضح هنا بعناية أمر ضروري لمنع نمو الورم خارج الجمجمة.
Introduction
الورم الأرومي الدبقي (GBM ؛ الورم الدبقي من الدرجة الرابعة) هو ورم الدماغ الأكثر شيوعا والخبيث ، والعلاجات الحالية غير فعالة ، مما يؤدي إلى بقاء متوسط 15 شهرا1. تعد النماذج قبل السريرية الموثوقة والدقيقة التي تمثل مسارات الإشارات المعقدة المشاركة في نمو ورم الدماغ والتسبب في المرض ضرورية لتسريع التقدم في تقييم الأنظمة العلاجية الجديدة ل GBM. لا تعكس نماذج الفئران التي يتم فيها زرع خطوط خلايا ورم الدماغ البشري تحت الجلد في الفئران التي تعاني من نقص المناعة البيئة المناعية الأصلية لأورام المخ ، ولا يمكن استخدامها لتقييم قدرة العلاجات على عبور الحاجز الدموي الدماغي2. من الناحية المثالية ، يجب أن تتكاثر نماذج الفئران قبل السريرية أيضا عن كثب في علم أمراض الأنسجة البشرية GBM ، بما في ذلك المستوى العالي من الغزو في الحمة المحيطة3. على الرغم من أن نماذج الفئران المعدلة وراثيا (GEM) تطور الأورام في سياق نظام مناعي سليم ، إلا أن خطط التكاثر المعقدة غالبا ما تكون مطلوبة ، وقد تتطور الأورام ببطء وبشكل غير متسق4. تعد نماذج الطعم الخيفي المشتقة من GEM أكثر ملاءمة للدراسات العلاجية قبل السريرية ، حيث تكون هناك حاجة إلى مجموعات كبيرة من الفئران الحاملة للورم في إطار زمني أقصر.
في تقرير سابق ، وصفنا نموذج فأر GBM التقويمي المشتق مباشرة من أورام GEM. يبدأ تكوين الورم في GEM من خلال الأحداث الجينية في مجموعات الخلايا (الخلايا النجمية في المقام الأول) التي تعبر عن البروتين الحمضي الليفي الدبقي (GFAP) ، والتي تؤدي إلى التقدم إلى GBM. تحتوي هذه GEMs TRP على جين التحوير TgGZT121 (T) ، والذي يعبر عن T121 بعد التعرض لإعادة تجميع Cre التي يحركها GFAP. ينتج عن تعبير بروتين T121 قمع نشاط البروتين Rb (Rb1 و p107 و p103). يستهدف التعبير المشترك لجين التحوير Cre المدفوع ب GFAP (GFAP-CreERT2) التعبير للخلايا النجمية البالغة بعد تحريضه باستخدام عقار تاموكسيفين. تأوي فئران TRP أيضا Kras متحولة تعتمد على Cre (KrasG12D; R) أليل ، لتمثيل تنشيط مسار مستقبلات التيروزين كيناز ، وهي غير متجانسة الزيجوت لفقدان Pten (P) 5,6. الانحرافات الجينية المتزامنة في مستقبلات التيروزين كيناز (RTK) وشبكات PI3K و RB متورطة في 74٪ من التسبب في GBM7. لذلك ، يتم تمثيل مسارات الإشارات الأولية التي تم تغييرها في GBM البشري من خلال الطفرات المهندسة في الفئران TRP ، ولا سيما أورام GBM ، حيث يتم تنشيط أهداف المصب المشتركة ل RTKs5.
تم التحقق من صحة نموذج تقويم العظام الجيني المشتق من GEM كنموذج يلخص ميزات أورام الدماغ البشرية ، بما في ذلك الغزو ووجود المؤشرات الحيوية من النوع الفرعي ، لاستخدامه كمنصة لتقييم علاجات السرطان التي تستهدف المسارات الشاذة في GBM. تم استزراع الخلايا من الأورام التي تم حصادها من أدمغة TRP وإعادة زرعها في دماغ الفئران المتطابقة مع الإجهاد ، باستخدام معدات التوضيع التجسيمي للحقن داخل الجمجمة في القشرة. طور نموذج الفأر التقويمي قبل السريري هذا أوراما GBM كانت خلوية للغاية ، وغازية ، ومتعددة الأشكال مع معدل انقسام مرتفع ، وأظهرت بؤرا خطية للنخر بواسطة الخلايا الورمية والأوعية الدموية الكثيفة ، كما لوحظ بالنسبة ل GBM البشري. تم قياس حجم الورم ونموه بواسطة التصوير بالرنين المغناطيسي في الجسم الحي (MRI).
في هذا التقرير ، نصف التقنية المثلى للحقن داخل الجمجمة لخلايا GBM الأولية أو خطوط الخلايا في دماغ الفأر من النوع البري ، باستخدام أورام TRP كمثال. يمكن تكييف نفس البروتوكول للفئران التي تعاني من نقص المناعة وخطوط خلايا GBM الأخرى. يتم تقديم نصائح حاسمة لتجنب المزالق الشائعة ، مثل تحضير الخلايا دون المستوى الأمثل أو تسرب الخلايا في موقع الحقن ، ولاستخدام معدات التوضيع التجسيمي بشكل صحيح لضمان استنساخ النموذج وموثوقيته. لأغراض متعدية ، نقوم بالتحقق من صحة النموذج عن طريق الكشف بالرنين المغناطيسي عن نمو ورم المخ في الحيوانات الحية ، والتوصيف النسيجي ، وتقديم مثال على العلاج في الفئران الحاملة للورم.
Protocol
Representative Results
Discussion
النماذج قبل السريرية ضرورية لتقييم الأهداف العلاجية الجديدة واستراتيجيات العلاج الجديدة في GBM. تتمتع نماذج الفئران المعدلة وراثيا ل GBM بميزة حدوث الورم في الموقع الأصلي ، ولكن غالبا مع زمن انتقال طويل ونمو ورم لا يمكن التنبؤ به13. تظهر أورام نموذج GEM زمن انتقال من 4-5 أشهر ، والن?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
كولاغا على المساعدة التقنية الممتازة وللسيدة ميشيل ل. غومبريخت على صقل التقنيات الجراحية. نشكر الدكتور فيليب إل مارتن على تحليل علم الأمراض والسيدة ليليا إليفا والدكتور جوزيف كالين من برنامج تصوير الحيوانات الصغيرة في مختبر فريدريك الوطني لإجراء فحوصات التصوير بالرنين المغناطيسي.
تم تمويل هذا المشروع كليا أو جزئيا بأموال اتحادية من المعهد الوطني للسرطان ، المعاهد الوطنية للصحة ، بموجب العقد رقم HHSN261201500003I. لا يعكس محتوى هذا المنشور بالضرورة آراء أو سياسات وزارة الصحة والخدمات الإنسانية ، ولا يعني ذكر الأسماء التجارية أو المنتجات التجارية أو المنظمات موافقة حكومة الولايات المتحدة.
Materials
| 5% methylcellulose in 1X PBS, autoclaved | Millipore Sigma | M7027 | |
| 1mL Tuberculin Syringe, slip tip | BD | 309659 | |
| 6" Cotton Tipped Applicators | Puritan | S-18991 | |
| Adjustable stage platform | David Kopf Instruments | Model 901 | |
| Aerosol Barrier Tips | Fisher Scientific | 02-707-33 | |
| Alcohol Prep Pads Sterile, Large – 2.5 x 3 Inch | PDI | C69900 | |
| B6D2 mouse strain (C57Bl/6J x DBA/2J) | Jackson Laboratory | Jax #10006 | |
| Bone Wax | Surgical Specialties | 901 | |
| Bupivacaine 0.25% | Henry Schein | 6023287 | |
| BuprenorphineSR | ZooPharm | n/a | |
| Clear Vinyl Tubing 1/8ID X 3/16OD | UDP | T10004001 | |
| CVS Lubricant Eye Ointment | CVS Pharmacy | 247881 | |
| Disposable Scalpels, #10 blade | Scalpel Miltex | 16-63810 | |
| Gas anesthesia machine with oxygen hook-up and anesthesia box | Somni Scientific | n/a | Investigator may use facility standard equipment |
| Gas anesthesia platform for mice | David Kopf Instruments | Model 923-B | |
| GraphPad Prism | Graphpad | Prism 9 version 9.4.1 | |
| Hamilton 30 g needle, ½ “, small hub, point pst 3 | Hamilton | Special Order | |
| Hamilton precision microliter syringe, 1701 RN, no needle 10 µL | Hamilton | 7653-01 | |
| Hot bead sterilizer with beads | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Invitrogen Countess 3 Automated Cell Counter | Fisher Scientific | AMQAX2000 | |
| IsoFlurane | Piramal Critical Care | 29404 | |
| Isopropyl Alcohol Prep Pads | PDI | C69900 | |
| ITK_SNAP (Version 36.X, 2011-present) | Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at the University of Utah | ||
| KOPF Small Animal Stereotaxic Instrument with digital readout console | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Masterflex Fitting, PVDF, Straight, Hose Barb Reducer, 1/4" ID x 1/8" ID | Masterflex | HV-30616-16 | |
| Mouse Heating Plate | David Kopf Instruments | PH HP-4M | |
| Mouse Rectal Probe | David Kopf Instruments | PH RET-3-ISO | |
| Nalgene Super Versi-Dry Surface Protectors | ThermoFisher Scientific | 74000-00 | |
| P20 pipette | Gilson | F123600 | |
| Povidone Iodine Surgical Scrub | Dynarex | 1415 | |
| Reflex 9 mm Wound Clip Applicator | Fine Science Tools | 12031-09 | |
| Reflex 9 mm Wound Clip Remover | Fine Science Tools | 12033-00 | |
| Reflex 9 mm Wound Clips | Fine Science Tools | 12032-09 | |
| Semken forceps, curved | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Temperature Controller | David Kopf Instruments | PH TCAT-2LV | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Tuberculin Syringe with 25g needle, slip tip | BD | 309626 | |
| UltraMicroPump 3 with Micro2T Controller | World Precision Instruments | Model UMP3T |
Referências
- Tamimi, A. F., Juweid, M. Epidemiology and Outcome of Glioblastoma. Glioblastoma. , (2017).
- Robertson, F. L., Marques-Torrejon, M. A., Morrison, G. M., Pollard, S. M. Experimental models and tools to tackle glioblastoma. Disease Models & Mechanisms. 12 (9), (2019).
- Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults. The New England Journal of Medicine. 359 (5), 492-507 (2008).
- Haddad, A. F., et al. Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies. Neuro-Oncology Advances. 3 (1), (2021).
- El Meskini, R., et al. A preclinical orthotopic model for glioblastoma recapitulates key features of human tumors and demonstrates sensitivity to a combination of MEK and PI3K pathway inhibitors. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 45-56 (2015).
- Song, Y., et al. Evolutionary etiology of high-grade astrocytomas. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (44), 17933-17938 (2013).
- Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 455 (7216), 1061-1068 (2008).
- Motomura, K., et al. Immunohistochemical analysis-based proteomic subclassification of newly diagnosed glioblastomas. Cancer Science. 103 (10), 1871-1879 (2012).
- Choyke, P. L., Dwyer, A. J., Knopp, M. V. Functional tumor imaging with dynamic contrast-enhanced magnetic resonance imaging. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 17 (5), 509-520 (2003).
- Raza, S. M., et al. Identification of necrosis-associated genes in glioblastoma by cDNA microarray analysis. Clinical Cancer Research. 10, 212-221 (2004).
- Raza, S. M., et al. Necrosis and glioblastoma: a friend or a foe? A review and a hypothesis. Neurosurgery. 51 (1), 2-12 (2002).
- Hambardzumyan, D., Bergers, G. Glioblastoma: defining tumor niches. Trends in Cancer. 1 (4), 252-265 (2015).
- Kijima, N., Kanemura, Y. Glioblastoma. Mouse Models of Glioblastoma. , (2017).
- Casanova, F., Carney, P. R., Sarntinoranont, M. Effect of needle insertion speed on tissue injury, stress, and backflow distribution for convection-enhanced delivery in the rat brain. PloS One. 9 (4), 94919 (2014).
- Jin, F., Jin-Lee, H. J., Johnson, A. J. Mouse Models of Experimental Glioblastoma. Gliomas. , (2021).
- Zalles, M., Towner, R. A. Pre-Clinical Models and Potential Novel Therapies for Glioblastomas. Gliomas. , 1-13 (2021).
- Wierzbicki, K., et al. Targeting and therapeutic monitoring of H3K27M-mutant glioma. Current Oncology Reports. 22 (2), 19 (2020).
