Her beskriver vi en præklinisk ortopisk musemodel for GBM, etableret ved intrakraniel injektion af celler afledt af genetisk manipulerede musemodeltumorer. Denne model viser sygdomskendetegnene for human GBM. Til translationelle undersøgelser spores musehjernetumoren ved in vivo MR og histopatologi.
Gensplejsede mus (GEM) modeller for human glioblastoma multiforme (GBM) er afgørende for at forstå udviklingen og progressionen af hjernetumorer. I modsætning til xenografttumorer opstår tumorer i GEM’er i det oprindelige mikromiljø i en immunkompetent mus. Imidlertid er brugen af GBM GEM’er i prækliniske behandlingsstudier udfordrende på grund af lange tumorlatenstider, heterogenitet i neoplasmafrekvens og tidspunktet for avanceret tumorudvikling. Mus induceret via intrakraniel ortopisk injektion er mere håndterbare til prækliniske undersøgelser og bevarer træk ved GEM-tumorerne. Vi genererede en ortopisk hjernetumormodel afledt af en GEM-model med Rb-, Kras- og p53-aberrationer (TRP), som udvikler GBM-tumorer, der viser lineære foci af nekrose af neoplastiske celler og tæt vaskularisering analog med human GBM. Celler afledt af GEM GBM-tumorer injiceres intrakranielt i vildtype, stammematchede modtagermus og reproducerer klasse IV-tumorer, hvilket omgår den lange tumorlatensperiode hos GEM-mus og muliggør oprettelse af store og reproducerbare kohorter til prækliniske undersøgelser. De meget proliferative, invasive og vaskulære træk ved TRP GEM-modellen for GBM rekapituleres i de ortotopiske tumorer, og histopatologiske markører afspejler humane GBM-undergrupper. Tumorvækst overvåges ved serielle MR-scanninger. På grund af den invasive karakter af de intrakranielle tumorer i immunkompetente modeller er det vigtigt at følge injektionsproceduren beskrevet her for at forhindre ekstrakraniel tumorvækst.
Glioblastom (GBM; grad IV gliom) er den mest almindelige og ondartede hjernetumor, og nuværende behandlinger er ineffektive, hvilket resulterer i en median overlevelse på 15 måneder1. Pålidelige og nøjagtige prækliniske modeller, der repræsenterer de komplekse signalveje, der er involveret i hjernetumorvækst og patogenese, er afgørende for at fremskynde fremskridtene med at evaluere nye terapeutiske regimer for GBM. Musemodeller, hvor humane hjernetumorcellelinjer implanteres subkutant i immunkompromitterede mus, afspejler ikke det oprindelige immunsystem i hjernetumorer, og de kan heller ikke bruges til at evaluere terapeutiske evne til at krydse blod-hjerne-barrieren2. Ideelt set bør prækliniske musemodeller også nøje reproducere den humane GBM-histopatologi, herunder det høje niveau af invasivitet i det omgivende parenkym3. Selvom genetisk manipulerede mus (GEM) modeller udvikler tumorer i forbindelse med et intakt immunsystem, kræves der ofte komplicerede avlsordninger, og tumorer kan udvikle sig langsomt og inkonsekvent4. GEM-afledte allograftmodeller er bedre egnet til prækliniske terapeutiske studier, hvor store kohorter af tumorbærende mus er nødvendige inden for en kortere tidsramme.
I en tidligere rapport beskrev vi en ortopisk GBM-musemodel afledt direkte af GEM-tumorer. Tumorigenese i GEM initieres af genetiske begivenheder i cellepopulationer (primært astrocytter), der udtrykker glialfibrillært surt protein (GFAP), der resulterer i progression til GBM. Disse TRP GEMs har et TgGZT121 transgen (T), som udtrykker T121 efter eksponering for den GFAP-drevne Cre-rekombinase. T121-proteinekspression resulterer i undertrykkelse af Rb (Rb1, p107 og p103) proteinaktivitet. Co-ekspression af et GFAP-drevet Cre-transgen (GFAP-CreERT2) målretter ekspression til voksne astrocytter efter induktion med tamoxifen. TRP-mus har også en Cre-afhængig mutant Kras (KrasG12D; R) allel, for at repræsentere aktivering af receptortyrosinkinasevejen og er heterozygote for tab af Pten (P)5,6. Samtidige genaberrationer i receptortyrosinkinase (RTK), PI3K og RB-netværk er impliceret i 74% af GBM-patogenese7. Derfor er de primære signalveje, der er ændret i human GBM, repræsenteret af de konstruerede mutationer i TRP-mus, især GBM-tumorer, hvor delte nedstrømsmål for RTK’er aktiveres5.
Den GEM-afledte syngeneiske ortopiske model blev valideret som en model, der rekapitulerer træk ved humane hjernetumorer, herunder invasivitet og tilstedeværelsen af subtype biomarkører, til brug som en platform til evaluering af kræftterapi rettet mod afvigende veje i GBM. Celler blev dyrket fra tumorer høstet fra TRP-hjerner og genimplanteret i hjernen hos stammematchede mus ved hjælp af stereotaktisk udstyr til intrakraniel injektion i cortex. Denne prækliniske ortotopiske musemodel udviklede GBM-tumorer, der var meget cellulære, invasive, pleomorfe med en høj mitotisk hastighed og viste lineære foci af nekrose ved neoplastiske celler og tæt vaskularisering, som observeret for human GBM. Tumorvolumener og vækst blev målt ved in vivo magnetisk resonansbilleddannelse (MRI).
I denne rapport beskriver vi den optimale teknik til intrakraniel injektion af primære GBM-celler eller cellelinjer i vildtypemusehjernen ved hjælp af TRP-tumorer som et eksempel. Den samme protokol kan tilpasses til immunkompromitterede mus og andre GBM-cellelinjer. Der gives afgørende tips til at undgå almindelige faldgruber, såsom suboptimal celleforberedelse eller cellelækage på injektionsstedet, og til at bruge det stereotaktiske udstyr korrekt for at sikre modellens reproducerbarhed og pålidelighed. Til translationelle formål validerer vi modellen ved MR-påvisning af hjernetumorvækst hos levende dyr, histologisk karakterisering og præsenterer et eksempel på behandling i tumorbærende mus.
Prækliniske modeller er afgørende for evalueringen af nye terapeutiske mål og nye behandlingsstrategier i GBM. Gensplejsede musemodeller for GBM har fordelen ved tumorforekomst på det autoktone sted, men ofte med lang latenstid og uforudsigelig tumorvækst13. GEM-modeltumorerne udviser en latenstid på 4-5 måneder, og det ideelle tidsvindue til billeddannelse, rekruttering og behandling varierer blandt individuelle mus. Den ortopiske model har en veletableret og medgørlig vækst- og behandli…
The authors have nothing to disclose.
Vi er taknemmelige for Alan E. Kulaga for fremragende teknisk assistance og fru Michelle L. Gumprecht for at forfine de kirurgiske teknikker. Vi takker Dr. Philip L. Martin for patologianalyse og fru Lilia Ileva og Dr. Joseph Kalen fra Frederick National Laboratory Small Animal Imaging Program for MR-scanninger.
Dette projekt er finansieret helt eller delvist med føderale midler fra National Cancer Institute, National Institutes of Health, under kontrakt nr. HHSN261201500003I. Indholdet af denne publikation afspejler ikke nødvendigvis synspunkter eller politikker fra Department of Health and Human Services, og omtalen af handelsnavne, kommercielle produkter eller organisationer indebærer heller ikke godkendelse fra den amerikanske regering.
5% methylcellulose in 1X PBS, autoclaved | Millipore Sigma | M7027 | |
1mL Tuberculin Syringe, slip tip | BD | 309659 | |
6" Cotton Tipped Applicators | Puritan | S-18991 | |
Adjustable stage platform | David Kopf Instruments | Model 901 | |
Aerosol Barrier Tips | Fisher Scientific | 02-707-33 | |
Alcohol Prep Pads Sterile, Large – 2.5 x 3 Inch | PDI | C69900 | |
B6D2 mouse strain (C57Bl/6J x DBA/2J) | Jackson Laboratory | Jax #10006 | |
Bone Wax | Surgical Specialties | 901 | |
Bupivacaine 0.25% | Henry Schein | 6023287 | |
BuprenorphineSR | ZooPharm | n/a | |
Clear Vinyl Tubing 1/8ID X 3/16OD | UDP | T10004001 | |
CVS Lubricant Eye Ointment | CVS Pharmacy | 247881 | |
Disposable Scalpels, #10 blade | Scalpel Miltex | 16-63810 | |
Gas anesthesia machine with oxygen hook-up and anesthesia box | Somni Scientific | n/a | Investigator may use facility standard equipment |
Gas anesthesia platform for mice | David Kopf Instruments | Model 923-B | |
GraphPad Prism | Graphpad | Prism 9 version 9.4.1 | |
Hamilton 30 g needle, ½ “, small hub, point pst 3 | Hamilton | Special Order | |
Hamilton precision microliter syringe, 1701 RN, no needle 10 µL | Hamilton | 7653-01 | |
Hot bead sterilizer with beads | Fine Science Tools | 18000-45 | |
Invitrogen Countess 3 Automated Cell Counter | Fisher Scientific | AMQAX2000 | |
IsoFlurane | Piramal Critical Care | 29404 | |
Isopropyl Alcohol Prep Pads | PDI | C69900 | |
ITK_SNAP (Version 36.X, 2011-present) | Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at the University of Utah | ||
KOPF Small Animal Stereotaxic Instrument with digital readout console | David Kopf Instruments | Model 940 | |
Masterflex Fitting, PVDF, Straight, Hose Barb Reducer, 1/4" ID x 1/8" ID | Masterflex | HV-30616-16 | |
Mouse Heating Plate | David Kopf Instruments | PH HP-4M | |
Mouse Rectal Probe | David Kopf Instruments | PH RET-3-ISO | |
Nalgene Super Versi-Dry Surface Protectors | ThermoFisher Scientific | 74000-00 | |
P20 pipette | Gilson | F123600 | |
Povidone Iodine Surgical Scrub | Dynarex | 1415 | |
Reflex 9 mm Wound Clip Applicator | Fine Science Tools | 12031-09 | |
Reflex 9 mm Wound Clip Remover | Fine Science Tools | 12033-00 | |
Reflex 9 mm Wound Clips | Fine Science Tools | 12032-09 | |
Semken forceps, curved | Fine Science Tools | 11009-13 | |
Temperature Controller | David Kopf Instruments | PH TCAT-2LV | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
Tuberculin Syringe with 25g needle, slip tip | BD | 309626 | |
UltraMicroPump 3 with Micro2T Controller | World Precision Instruments | Model UMP3T |