Translationele orthotopische modellen van glioblastoom multiforme
Summary
Hier beschrijven we een preklinisch orthotopisch muismodel voor GBM, vastgesteld door intracraniële injectie van cellen afgeleid van genetisch gemanipuleerde muismodeltumoren. Dit model toont de ziektekenmerken van menselijke GBM. Voor translationele studies wordt de hersentumor van de muis gevolgd door in vivo MRI en histopathologie.
Abstract
Genetisch gemanipuleerde muis (GEM) modellen voor menselijk glioblastoom multiforme (GBM) zijn van cruciaal belang voor het begrijpen van de ontwikkeling en progressie van hersentumoren. In tegenstelling tot xenografttumoren, ontstaan tumoren in GEM’s in de oorspronkelijke micro-omgeving in een immunocompetente muis. Het gebruik van GBM GEMs in preklinische behandelingsstudies is echter een uitdaging vanwege lange tumorlatenties, heterogeniteit in neoplasmafrequentie en de timing van geavanceerde tumorontwikkeling. Muizen geïnduceerd via intracraniële orthotopische injectie zijn beter handelbaar voor preklinische studies en behouden kenmerken van de GEM-tumoren. We genereerden een orthotopisch hersentumormodel afgeleid van een GEM-model met Rb, Kras en p53-aberraties (TRP), dat GBM-tumoren ontwikkelt met lineaire foci van necrose door neoplastische cellen en dichte vascularisatie analoog aan menselijke GBM. Cellen afgeleid van GEM GBM-tumoren worden intracraniaal geïnjecteerd in wild-type, stam-gematchte ontvangende muizen en reproduceren graad IV-tumoren, waardoor de lange tumorlatentieperiode bij GEM-muizen wordt omzeild en de creatie van grote en reproduceerbare cohorten voor preklinische studies mogelijk wordt. De zeer proliferatieve, invasieve en vasculaire kenmerken van het TRP GEM-model voor GBM worden samengevat in de orthotopische tumoren en histopathologiemarkers weerspiegelen menselijke GBM-subgroepen. Tumorgroei wordt gemonitord door seriële MRI-scans. Vanwege de invasieve aard van de intracraniële tumoren in immunocompetente modellen, is het zorgvuldig volgen van de hier beschreven injectieprocedure essentieel om extracraniële tumorgroei te voorkomen.
Introduction
Glioblastoom (GBM; graad IV glioom) is de meest voorkomende en kwaadaardige hersentumor en de huidige therapieën zijn niet effectief, wat resulteert in een mediane overleving van 15 maanden1. Betrouwbare en nauwkeurige preklinische modellen die de complexe signaalroutes vertegenwoordigen die betrokken zijn bij de groei en pathogenese van hersentumoren zijn essentieel om de vooruitgang bij het evalueren van nieuwe therapeutische regimes voor GBM te versnellen. Muismodellen waarin menselijke hersentumorcellijnen subcutaan worden geïmplanteerd in immuungecompromitteerde muizen weerspiegelen niet de inheemse immuunomgeving van hersentumoren, noch kunnen ze worden gebruikt om het vermogen van therapeutica om de bloed-hersenbarrière te passerente evalueren 2. Idealiter zouden preklinische muismodellen ook de menselijke GBM-histopathologie nauwkeurig moeten reproduceren, inclusief het hoge niveau van invasiviteit in het omringende parenchym3. Hoewel genetisch gemanipuleerde muismodellen (GEM) tumoren ontwikkelen in de context van een intact immuunsysteem, zijn er vaak gecompliceerde fokschema’s nodig en kunnen tumoren zich langzaam en inconsistent ontwikkelen4. GEM-afgeleide allograftmodellen zijn beter geschikt voor preklinische therapeutische studies, waarbij grote cohorten tumordragende muizen nodig zijn in een korter tijdsbestek.
In een eerder rapport beschreven we een orthotopisch GBM-muismodel dat rechtstreeks is afgeleid van GEM-tumoren. Tumorigenese in het GEM wordt geïnitieerd door genetische gebeurtenissen in celpopulaties (voornamelijk astrocyten) die gliaal fibrillair zuur eiwit (GFAP) tot expressie brengen, die resulteren in progressie naar GBM. Deze TRP GEMs bevatten een TgGZT121-transgen (T), dat T121 tot expressie brengt na blootstelling aan de GFAP-aangedreven Cre-recombinase. T121 eiwitexpressie resulteert in de onderdrukking van Rb (Rb1, p107 en p103) eiwitactiviteit. Co-expressie van een GFAP-gedreven Cre-transgen (GFAP-CreERT2) richt zich op expressie naar volwassen astrocyten na inductie met tamoxifen. TRP-muizen herbergen ook een Cre-afhankelijke mutant Kras (KrasG12D; R) allel, om de activering van de receptor tyrosine kinase route weer te geven, en zijn heterozygoot voor het verlies van Pten (P)5,6. Gelijktijdige genafwijkingen in de receptor tyrosinekinase (RTK), PI3K en RB-netwerken zijn betrokken bij 74% van de GBM-pathogenese7. Daarom worden de primaire signaalroutes die zijn veranderd in menselijke GBM vertegenwoordigd door de gemanipuleerde mutaties in TRP-muizen, in het bijzonder GBM-tumoren, waarin gedeelde downstream-doelen van RTK’s worden geactiveerd5.
Het gem-afgeleide syngenetische orthotopische model werd gevalideerd als een model dat kenmerken van menselijke hersentumoren samenvat, inclusief invasiviteit en de aanwezigheid van subtype biomarkers, voor gebruik als een platform om kankertherapieën te evalueren die gericht zijn op afwijkende routes in GBM. Cellen werden gekweekt uit tumoren geoogst uit TRP-hersenen en opnieuw geïmplanteerd in de hersenen van op stam afgestemde muizen, met behulp van stereotactische apparatuur voor intracraniële injectie in de cortex. Dit preklinische orthotopische muismodel ontwikkelde GBM-tumoren die zeer cellulair, invasief, pleomorf waren met een hoge mitotische snelheid en lineaire foci van necrose vertoonden door neoplastische cellen en dichte vascularisatie, zoals waargenomen voor menselijke GBM. Tumorvolumes en groei werden gemeten met in vivo magnetische resonantie beeldvorming (MRI).
In dit rapport beschrijven we de optimale techniek voor de intracraniële injectie van primaire GBM-cellen of cellijnen in het wild-type muizenbrein, met TRP-tumoren als voorbeeld. Hetzelfde protocol kan worden aangepast voor immuungecompromitteerde muizen en andere GBM-cellijnen. Cruciale tips worden gegeven voor het vermijden van veelvoorkomende valkuilen, zoals suboptimale celvoorbereiding of cellekkage op de injectieplaats, en voor het correct gebruiken van de stereotactische apparatuur om de reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid van het model te garanderen. Voor translationele doeleinden valideren we het model door MRI-detectie van hersentumorgroei bij levende dieren, histologische karakterisering en presenteren we een voorbeeld van behandeling bij tumordragende muizen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Preklinische modellen zijn essentieel voor de evaluatie van nieuwe therapeutische doelen en nieuwe behandelingsstrategieën in GBM. Genetisch gemanipuleerde muismodellen voor GBM hebben het voordeel dat tumoren voorkomen op de autochtone plaats, maar vaak met een lange latentie en onvoorspelbare tumorgroei13. De GEM-modeltumoren vertonen een latentie van 4-5 maanden en het ideale tijdvenster voor beeldvorming, rekrutering en behandeling is variabel bij individuele muizen. Het orthotopische model h…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn de heer Alan E. Kulaga dankbaar voor de uitstekende technische assistentie en mevrouw Michelle L. Gumprecht voor het verfijnen van de chirurgische technieken. We bedanken Dr. Philip L. Martin voor pathologie-analyse en mevrouw Lilia Ileva en Dr. Joseph Kalen van het Frederick National Laboratory Small Animal Imaging Program voor MRI-scans.
Dit project is geheel of gedeeltelijk gefinancierd met federale fondsen van het National Cancer Institute, National Institutes of Health, onder contractnummer HHSN261201500003I. De inhoud van deze publicatie weerspiegelt niet noodzakelijkerwijs de standpunten of het beleid van het ministerie van Volksgezondheid en Human Services, noch impliceert de vermelding van handelsnamen, commerciële producten of organisaties goedkeuring door de Amerikaanse overheid.
Materials
| 5% methylcellulose in 1X PBS, autoclaved | Millipore Sigma | M7027 | |
| 1mL Tuberculin Syringe, slip tip | BD | 309659 | |
| 6" Cotton Tipped Applicators | Puritan | S-18991 | |
| Adjustable stage platform | David Kopf Instruments | Model 901 | |
| Aerosol Barrier Tips | Fisher Scientific | 02-707-33 | |
| Alcohol Prep Pads Sterile, Large – 2.5 x 3 Inch | PDI | C69900 | |
| B6D2 mouse strain (C57Bl/6J x DBA/2J) | Jackson Laboratory | Jax #10006 | |
| Bone Wax | Surgical Specialties | 901 | |
| Bupivacaine 0.25% | Henry Schein | 6023287 | |
| BuprenorphineSR | ZooPharm | n/a | |
| Clear Vinyl Tubing 1/8ID X 3/16OD | UDP | T10004001 | |
| CVS Lubricant Eye Ointment | CVS Pharmacy | 247881 | |
| Disposable Scalpels, #10 blade | Scalpel Miltex | 16-63810 | |
| Gas anesthesia machine with oxygen hook-up and anesthesia box | Somni Scientific | n/a | Investigator may use facility standard equipment |
| Gas anesthesia platform for mice | David Kopf Instruments | Model 923-B | |
| GraphPad Prism | Graphpad | Prism 9 version 9.4.1 | |
| Hamilton 30 g needle, ½ “, small hub, point pst 3 | Hamilton | Special Order | |
| Hamilton precision microliter syringe, 1701 RN, no needle 10 µL | Hamilton | 7653-01 | |
| Hot bead sterilizer with beads | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Invitrogen Countess 3 Automated Cell Counter | Fisher Scientific | AMQAX2000 | |
| IsoFlurane | Piramal Critical Care | 29404 | |
| Isopropyl Alcohol Prep Pads | PDI | C69900 | |
| ITK_SNAP (Version 36.X, 2011-present) | Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at the University of Utah | ||
| KOPF Small Animal Stereotaxic Instrument with digital readout console | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Masterflex Fitting, PVDF, Straight, Hose Barb Reducer, 1/4" ID x 1/8" ID | Masterflex | HV-30616-16 | |
| Mouse Heating Plate | David Kopf Instruments | PH HP-4M | |
| Mouse Rectal Probe | David Kopf Instruments | PH RET-3-ISO | |
| Nalgene Super Versi-Dry Surface Protectors | ThermoFisher Scientific | 74000-00 | |
| P20 pipette | Gilson | F123600 | |
| Povidone Iodine Surgical Scrub | Dynarex | 1415 | |
| Reflex 9 mm Wound Clip Applicator | Fine Science Tools | 12031-09 | |
| Reflex 9 mm Wound Clip Remover | Fine Science Tools | 12033-00 | |
| Reflex 9 mm Wound Clips | Fine Science Tools | 12032-09 | |
| Semken forceps, curved | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Temperature Controller | David Kopf Instruments | PH TCAT-2LV | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Tuberculin Syringe with 25g needle, slip tip | BD | 309626 | |
| UltraMicroPump 3 with Micro2T Controller | World Precision Instruments | Model UMP3T |
Referências
- Tamimi, A. F., Juweid, M. Epidemiology and Outcome of Glioblastoma. Glioblastoma. , (2017).
- Robertson, F. L., Marques-Torrejon, M. A., Morrison, G. M., Pollard, S. M. Experimental models and tools to tackle glioblastoma. Disease Models & Mechanisms. 12 (9), (2019).
- Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults. The New England Journal of Medicine. 359 (5), 492-507 (2008).
- Haddad, A. F., et al. Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies. Neuro-Oncology Advances. 3 (1), (2021).
- El Meskini, R., et al. A preclinical orthotopic model for glioblastoma recapitulates key features of human tumors and demonstrates sensitivity to a combination of MEK and PI3K pathway inhibitors. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 45-56 (2015).
- Song, Y., et al. Evolutionary etiology of high-grade astrocytomas. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (44), 17933-17938 (2013).
- Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 455 (7216), 1061-1068 (2008).
- Motomura, K., et al. Immunohistochemical analysis-based proteomic subclassification of newly diagnosed glioblastomas. Cancer Science. 103 (10), 1871-1879 (2012).
- Choyke, P. L., Dwyer, A. J., Knopp, M. V. Functional tumor imaging with dynamic contrast-enhanced magnetic resonance imaging. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 17 (5), 509-520 (2003).
- Raza, S. M., et al. Identification of necrosis-associated genes in glioblastoma by cDNA microarray analysis. Clinical Cancer Research. 10, 212-221 (2004).
- Raza, S. M., et al. Necrosis and glioblastoma: a friend or a foe? A review and a hypothesis. Neurosurgery. 51 (1), 2-12 (2002).
- Hambardzumyan, D., Bergers, G. Glioblastoma: defining tumor niches. Trends in Cancer. 1 (4), 252-265 (2015).
- Kijima, N., Kanemura, Y. Glioblastoma. Mouse Models of Glioblastoma. , (2017).
- Casanova, F., Carney, P. R., Sarntinoranont, M. Effect of needle insertion speed on tissue injury, stress, and backflow distribution for convection-enhanced delivery in the rat brain. PloS One. 9 (4), 94919 (2014).
- Jin, F., Jin-Lee, H. J., Johnson, A. J. Mouse Models of Experimental Glioblastoma. Gliomas. , (2021).
- Zalles, M., Towner, R. A. Pre-Clinical Models and Potential Novel Therapies for Glioblastomas. Gliomas. , 1-13 (2021).
- Wierzbicki, K., et al. Targeting and therapeutic monitoring of H3K27M-mutant glioma. Current Oncology Reports. 22 (2), 19 (2020).
