ग्लियोब्लास्टोमा मल्टीफॉर्म के ट्रांसलेशनल ऑर्थोटोपिक मॉडल
Summary
यहां, हम जीबीएम के लिए एक प्रीक्लिनिकल ऑर्थोटोपिक माउस मॉडल का वर्णन करते हैं, जो आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल ट्यूमर से प्राप्त कोशिकाओं के इंट्राक्रैनील इंजेक्शन द्वारा स्थापित है। यह मॉडल मानव जीबीएम के रोग हॉलमार्क प्रदर्शित करता है। ट्रांसलेशनल अध्ययन के लिए, माउस ब्रेन ट्यूमर को विवो एमआरआई और हिस्टोपैथोलॉजी में ट्रैक किया जाता है।
Abstract
मानव ग्लियोब्लास्टोमा मल्टीफॉर्म (जीबीएम) के लिए आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस (जीईएम) मॉडल मस्तिष्क ट्यूमर के विकास और प्रगति को समझने के लिए महत्वपूर्ण हैं। जेनोग्राफ्ट ट्यूमर के विपरीत, जीईएम में, ट्यूमर एक इम्यूनोसक्षम माउस में देशी माइक्रोएन्वायरमेंट में उत्पन्न होते हैं। हालांकि, प्रीक्लिनिकल उपचार अध्ययनों में जीबीएम जीईएम का उपयोग लंबे ट्यूमर लेटेंसी, नियोप्लाज्म आवृत्ति में विषमता और उन्नत ग्रेड ट्यूमर के विकास के समय के कारण चुनौतीपूर्ण है। इंट्राक्रैनील ऑर्थोटोपिक इंजेक्शन के माध्यम से प्रेरित चूहे प्रीक्लिनिकल अध्ययनों के लिए अधिक साध्य हैं, और जीईएम ट्यूमर की विशेषताओं को बनाए रखते हैं। हमने आरबी, क्रास और पी 53 विपथन (टीआरपी) के साथ जीईएम मॉडल से प्राप्त एक ऑर्थोटोपिक ब्रेन ट्यूमर मॉडल उत्पन्न किया, जो नियोप्लास्टिक कोशिकाओं द्वारा नेक्रोसिस के रैखिक फॉसी को प्रदर्शित करने वाले जीबीएम ट्यूमर विकसित करता है, और मानव जीबीएम के अनुरूप घने वैस्कुलराइजेशन को प्रदर्शित करता है। जीईएम जीबीएम ट्यूमर से प्राप्त कोशिकाओं को जंगली-प्रकार, तनाव-मिलान प्राप्तकर्ता चूहों में इंट्राक्रैनियल रूप से इंजेक्ट किया जाता है और ग्रेड IV ट्यूमर को पुन: पेश किया जाता है, इसलिए जीईएम चूहों में लंबी ट्यूमर विलंबता अवधि को दरकिनार किया जाता है और प्रीक्लिनिकल अध्ययनों के लिए बड़े और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य समूहों के निर्माण की अनुमति मिलती है। जीबीएम के लिए टीआरपी जीईएम मॉडल की अत्यधिक प्रोलिफ़ेरेटिव, इनवेसिव और संवहनी विशेषताओं को ऑर्थोटोपिक ट्यूमर में पुन: प्रस्तुत किया जाता है, और हिस्टोपैथोलॉजी मार्कर मानव जीबीएम उपसमूहों को दर्शाते हैं। सीरियल एमआरआई स्कैन द्वारा ट्यूमर के विकास की निगरानी की जाती है। इम्यूनोसक्षम मॉडल में इंट्राक्रैनील ट्यूमर की आक्रामक प्रकृति के कारण, एक्स्ट्राक्रैनियल ट्यूमर के विकास को रोकने के लिए यहां उल्लिखित इंजेक्शन प्रक्रिया का सावधानीपूर्वक पालन करना आवश्यक है।
Introduction
ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम; ग्रेड IV ग्लियोमा) सबसे आम और घातक मस्तिष्क ट्यूमर है, और वर्तमान उपचार अप्रभावी हैं, जिसके परिणामस्वरूप 15 महीने का औसत अस्तित्वहै। विश्वसनीय और सटीक प्रीक्लिनिकल मॉडल जो मस्तिष्क ट्यूमर के विकास और रोगजनन में शामिल जटिल सिग्नलिंग मार्गों का प्रतिनिधित्व करते हैं, जीबीएम के लिए नए चिकित्सीय आहार के मूल्यांकन में प्रगति में तेजी लाने के लिए आवश्यक हैं। माउस मॉडल जिसमें मानव मस्तिष्क ट्यूमर सेल लाइनों को इम्यूनोकॉम्प्रोमाइज्ड चूहों में चमड़े के नीचे प्रत्यारोपित किया जाता है, मस्तिष्क ट्यूमर के मूल प्रतिरक्षा वातावरण को प्रतिबिंबित नहीं करते हैं, न ही उनका उपयोग रक्त-मस्तिष्क बाधा2 को पार करने के लिए चिकित्सीय की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है। आदर्श रूप से, प्रीक्लिनिकल माउस मॉडल को मानव जीबीएम हिस्टोपैथोलॉजी को भी बारीकी से पुन: पेश करना चाहिए, जिसमें आसपास के पैरेन्काइमा3 में आक्रामकता का उच्च स्तर शामिल है। यद्यपि आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस (जीईएम) मॉडल एक बरकरार प्रतिरक्षा प्रणाली के संदर्भ में ट्यूमर विकसित करते हैं, जटिल प्रजनन योजनाओं की अक्सर आवश्यकता होती है, और ट्यूमर धीरे-धीरेऔर असंगत रूप से विकसित हो सकते हैं। जीईएम-व्युत्पन्न एलोग्राफ्ट मॉडल प्रीक्लिनिकल चिकित्सीय अध्ययनों के लिए बेहतर अनुकूल हैं, जहां कम समय सीमा में ट्यूमर-असर चूहों के बड़े समूहों की आवश्यकता होती है।
पिछली रिपोर्ट में, हमने जीईएम ट्यूमर से सीधे प्राप्त एक ऑर्थोटोपिक जीबीएम माउस मॉडल का वर्णन किया। जीईएम में ट्यूमरजेनिसिस कोशिका आबादी (मुख्य रूप से एस्ट्रोसाइट्स) में आनुवंशिक घटनाओं से शुरू होता है जो ग्लियल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी) को व्यक्त करता है, जिसके परिणामस्वरूप जीबीएम की प्रगति होती है। इन टीआरपी जीईएम में एक टीजीजीजेडटी 121 ट्रांसजीन (टी) होता है, जो जीएफएपी-संचालित क्रे रिकोम्बिनेस के संपर्क में आने के बाद टी 121 को व्यक्त करता है। टी 121 प्रोटीन अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप आरबी (आरबी 1, पी 107, और पी 103) प्रोटीन गतिविधि का दमन होता है। जीएफएपी-संचालित क्रे ट्रांसजेन (जीएफएपी-सीआरईआरटी 2) की सह-अभिव्यक्ति टैमोक्सीफेन के साथ प्रेरण के बाद वयस्क एस्ट्रोसाइट्स को अभिव्यक्ति को लक्षित करती है। टीआरपी चूहों में क्रे-निर्भर उत्परिवर्ती क्रास (क्रास जी 12 डी; क्रासजी 12 डी) भी होता है। आर) एलील, रिसेप्टर टायरोसिन किनेज मार्ग के सक्रियण का प्रतिनिधित्व करने के लिए, और पीटीएन (पी) 5,6 के नुकसान के लिए विषम युग्मित हैं। रिसेप्टर टायरोसिन किनेज (आरटीके), पीआई 3 के और आरबी नेटवर्क में समवर्ती जीन विपथन जीबीएम रोगजनन7 के 74% में फंसे हुए हैं। इसलिए, मानव जीबीएम में परिवर्तित प्राथमिक सिग्नलिंग मार्गों को टीआरपी चूहों में इंजीनियर उत्परिवर्तन द्वारा दर्शाया जाता है, विशेष रूप से जीबीएम ट्यूमर, जिसमें आरटीके के साझा डाउनस्ट्रीमलक्ष्य सक्रिय होते हैं।
जीईएम-व्युत्पन्न सिंजेनिक ऑर्थोटोपिक मॉडल को एक मॉडल के रूप में मान्य किया गया था जो जीबीएम में असामान्य मार्गों को लक्षित करने वाले कैंसर चिकित्सीय का मूल्यांकन करने के लिए एक मंच के रूप में उपयोग के लिए इनवेसिवनेस और उपप्रकार बायोमार्कर की उपस्थिति सहित मानव मस्तिष्क ट्यूमर की विशेषताओं को पुन: प्रस्तुत करता है। कोशिकाओं को टीआरपी दिमाग से काटे गए ट्यूमर से सुसंस्कृत किया गया था और कॉर्टेक्स में इंट्राक्रैनील इंजेक्शन के लिए स्टीरियोटैक्टिक उपकरण का उपयोग करके तनाव-मिलान वाले चूहों के मस्तिष्क में फिर से प्रत्यारोपित किया गया था। इस प्रीक्लिनिकल ऑर्थोटोपिक माउस मॉडल ने जीबीएम ट्यूमर विकसित किए जो उच्च माइटोटिक दर के साथ अत्यधिक सेलुलर, इनवेसिव, प्लियोमॉर्फिक थे, और नियोप्लास्टिक कोशिकाओं और घने वैस्कुलराइजेशन द्वारा नेक्रोसिस के रैखिक फॉसी को प्रदर्शित करते थे, जैसा कि मानव जीबीएम के लिए देखा गया था। ट्यूमर की मात्रा और विकास को विवो चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) में मापा गया था।
इस रिपोर्ट में, हम एक उदाहरण के रूप में टीआरपी ट्यूमर का उपयोग करते हुए, जंगली प्रकार के माउस मस्तिष्क में प्राथमिक जीबीएम कोशिकाओं या सेल लाइनों के इंट्राक्रैनील इंजेक्शन के लिए इष्टतम तकनीक का वर्णन करते हैं। एक ही प्रोटोकॉल इम्यूनोकॉम्प्रोमाइज्ड चूहों और अन्य जीबीएम सेल लाइनों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। सामान्य नुकसान से बचने के लिए महत्वपूर्ण सुझाव दिए जाते हैं, जैसे कि इंजेक्शन साइट पर सबऑप्टिमल सेल तैयारी या सेल रिसाव, और मॉडल प्रजनन क्षमता और विश्वसनीयता सुनिश्चित करने के लिए स्टीरियोटैक्टिक उपकरण का सही ढंग से उपयोग करने के लिए। ट्रांसलेशनल उद्देश्यों के लिए, हम जीवित जानवरों में मस्तिष्क ट्यूमर के विकास का एमआरआई पता लगाने, हिस्टोलॉजिकल लक्षण वर्णन, और ट्यूमर-असर चूहों में उपचार का एक उदाहरण प्रस्तुत करके मॉडल को मान्य करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
जीबीएम में नए चिकित्सीय लक्ष्यों और नवीन उपचार रणनीतियों के मूल्यांकन के लिए प्रीक्लिनिकल मॉडल आवश्यक हैं। जीबीएम के लिए आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल में ऑटोक्थोनस साइट में ट्यूमर की घटना का ल…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए श्री एलन ई कुलागा और सर्जिकल तकनीकों को परिष्कृत करने के लिए सुश्री मिशेल एल गुम्प्रेच के आभारी हैं। हम पैथोलॉजी विश्लेषण के लिए डॉ फिलिप एल मार्टिन और एमआरआई स्कैन के लिए फ्रेडरिक नेशनल लेबोरेटरी स्मॉल एनिमल इमेजिंग प्रोग्राम की सुश्री लिलिया इलेवा और डॉ जोसेफ कालेन को धन्यवाद देते हैं।
इस परियोजना को अनुबंध संख्या एचएचएसएन 261201500003आई के तहत राष्ट्रीय कैंसर संस्थान, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान से संघीय धन के साथ पूरी तरह से या आंशिक रूप से वित्त पोषित किया गया है। इस प्रकाशन की सामग्री आवश्यक रूप से स्वास्थ्य और मानव सेवा विभाग के विचारों या नीतियों को प्रतिबिंबित नहीं करती है, न ही व्यापार नामों, वाणिज्यिक उत्पादों या संगठनों का उल्लेख अमेरिकी सरकार द्वारा समर्थन का अर्थ है।
Materials
| 5% methylcellulose in 1X PBS, autoclaved | Millipore Sigma | M7027 | |
| 1mL Tuberculin Syringe, slip tip | BD | 309659 | |
| 6" Cotton Tipped Applicators | Puritan | S-18991 | |
| Adjustable stage platform | David Kopf Instruments | Model 901 | |
| Aerosol Barrier Tips | Fisher Scientific | 02-707-33 | |
| Alcohol Prep Pads Sterile, Large – 2.5 x 3 Inch | PDI | C69900 | |
| B6D2 mouse strain (C57Bl/6J x DBA/2J) | Jackson Laboratory | Jax #10006 | |
| Bone Wax | Surgical Specialties | 901 | |
| Bupivacaine 0.25% | Henry Schein | 6023287 | |
| BuprenorphineSR | ZooPharm | n/a | |
| Clear Vinyl Tubing 1/8ID X 3/16OD | UDP | T10004001 | |
| CVS Lubricant Eye Ointment | CVS Pharmacy | 247881 | |
| Disposable Scalpels, #10 blade | Scalpel Miltex | 16-63810 | |
| Gas anesthesia machine with oxygen hook-up and anesthesia box | Somni Scientific | n/a | Investigator may use facility standard equipment |
| Gas anesthesia platform for mice | David Kopf Instruments | Model 923-B | |
| GraphPad Prism | Graphpad | Prism 9 version 9.4.1 | |
| Hamilton 30 g needle, ½ “, small hub, point pst 3 | Hamilton | Special Order | |
| Hamilton precision microliter syringe, 1701 RN, no needle 10 µL | Hamilton | 7653-01 | |
| Hot bead sterilizer with beads | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Invitrogen Countess 3 Automated Cell Counter | Fisher Scientific | AMQAX2000 | |
| IsoFlurane | Piramal Critical Care | 29404 | |
| Isopropyl Alcohol Prep Pads | PDI | C69900 | |
| ITK_SNAP (Version 36.X, 2011-present) | Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at the University of Utah | ||
| KOPF Small Animal Stereotaxic Instrument with digital readout console | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Masterflex Fitting, PVDF, Straight, Hose Barb Reducer, 1/4" ID x 1/8" ID | Masterflex | HV-30616-16 | |
| Mouse Heating Plate | David Kopf Instruments | PH HP-4M | |
| Mouse Rectal Probe | David Kopf Instruments | PH RET-3-ISO | |
| Nalgene Super Versi-Dry Surface Protectors | ThermoFisher Scientific | 74000-00 | |
| P20 pipette | Gilson | F123600 | |
| Povidone Iodine Surgical Scrub | Dynarex | 1415 | |
| Reflex 9 mm Wound Clip Applicator | Fine Science Tools | 12031-09 | |
| Reflex 9 mm Wound Clip Remover | Fine Science Tools | 12033-00 | |
| Reflex 9 mm Wound Clips | Fine Science Tools | 12032-09 | |
| Semken forceps, curved | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Temperature Controller | David Kopf Instruments | PH TCAT-2LV | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Tuberculin Syringe with 25g needle, slip tip | BD | 309626 | |
| UltraMicroPump 3 with Micro2T Controller | World Precision Instruments | Model UMP3T |
Referências
- Tamimi, A. F., Juweid, M. Epidemiology and Outcome of Glioblastoma. Glioblastoma. , (2017).
- Robertson, F. L., Marques-Torrejon, M. A., Morrison, G. M., Pollard, S. M. Experimental models and tools to tackle glioblastoma. Disease Models & Mechanisms. 12 (9), (2019).
- Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults. The New England Journal of Medicine. 359 (5), 492-507 (2008).
- Haddad, A. F., et al. Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies. Neuro-Oncology Advances. 3 (1), (2021).
- El Meskini, R., et al. A preclinical orthotopic model for glioblastoma recapitulates key features of human tumors and demonstrates sensitivity to a combination of MEK and PI3K pathway inhibitors. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 45-56 (2015).
- Song, Y., et al. Evolutionary etiology of high-grade astrocytomas. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (44), 17933-17938 (2013).
- Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 455 (7216), 1061-1068 (2008).
- Motomura, K., et al. Immunohistochemical analysis-based proteomic subclassification of newly diagnosed glioblastomas. Cancer Science. 103 (10), 1871-1879 (2012).
- Choyke, P. L., Dwyer, A. J., Knopp, M. V. Functional tumor imaging with dynamic contrast-enhanced magnetic resonance imaging. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 17 (5), 509-520 (2003).
- Raza, S. M., et al. Identification of necrosis-associated genes in glioblastoma by cDNA microarray analysis. Clinical Cancer Research. 10, 212-221 (2004).
- Raza, S. M., et al. Necrosis and glioblastoma: a friend or a foe? A review and a hypothesis. Neurosurgery. 51 (1), 2-12 (2002).
- Hambardzumyan, D., Bergers, G. Glioblastoma: defining tumor niches. Trends in Cancer. 1 (4), 252-265 (2015).
- Kijima, N., Kanemura, Y. Glioblastoma. Mouse Models of Glioblastoma. , (2017).
- Casanova, F., Carney, P. R., Sarntinoranont, M. Effect of needle insertion speed on tissue injury, stress, and backflow distribution for convection-enhanced delivery in the rat brain. PloS One. 9 (4), 94919 (2014).
- Jin, F., Jin-Lee, H. J., Johnson, A. J. Mouse Models of Experimental Glioblastoma. Gliomas. , (2021).
- Zalles, M., Towner, R. A. Pre-Clinical Models and Potential Novel Therapies for Glioblastomas. Gliomas. , 1-13 (2021).
- Wierzbicki, K., et al. Targeting and therapeutic monitoring of H3K27M-mutant glioma. Current Oncology Reports. 22 (2), 19 (2020).
