Здесь мы описываем доклиническую ортотопическую модель мыши для GBM, созданную путем внутричерепной инъекции клеток, полученных из генетически модифицированных опухолей мыши. Эта модель отображает признаки заболевания ГБМ человека. Для трансляционных исследований опухоль головного мозга мыши отслеживается с помощью МРТ in vivo и гистопатологии.
Генетически модифицированные мышиные модели (GEM) для мультиформной глиобластомы человека (GBM) имеют решающее значение для понимания развития и прогрессирования опухолей головного мозга. В отличие от опухолей ксенотрансплантата, в ГЭУ опухоли возникают в нативном микроокружении у иммунокомпетентной мыши. Тем не менее, использование GBM GEM в доклинических исследованиях лечения является сложной задачей из-за длительных латентных периодов опухоли, гетерогенности частоты новообразований и сроков развития опухоли поздней степени. Мыши, индуцированные с помощью внутричерепной ортотопической инъекции, более пригодны для доклинических исследований и сохраняют черты опухолей GEM. Мы создали ортотопическую модель опухоли головного мозга, полученную из модели GEM с аберрациями Rb, Kras и p53 (TRP), в которой развиваются опухоли GBM, демонстрирующие линейные очаги некроза опухолевыми клетками и плотную васкуляризацию, аналогичную GBM человека. Клетки, полученные из опухолей GEM GBM, вводят внутричерепно мышам-реципиентам дикого типа, соответствующим штамму, и воспроизводят опухоли IV степени, таким образом, обходя длительный латентный период опухоли у мышей GEM и позволяя создавать большие и воспроизводимые когорты для доклинических исследований. Высокопролиферативные, инвазивные и сосудистые особенности модели TRP GEM для GBM повторяются в ортотопических опухолях, а гистопатологические маркеры отражают подгруппы GBM человека. Рост опухоли контролируется серийными МРТ-сканированиями. Из-за инвазивного характера внутричерепных опухолей в иммунокомпетентных моделях тщательное следование описанной здесь процедуре инъекции имеет важное значение для предотвращения роста экстракраниальной опухоли.
Глиобластома (GBM; глиома IV степени) является наиболее распространенной и злокачественной опухолью головного мозга, и современные методы лечения неэффективны, что приводит к средней выживаемости 15 месяцев1. Надежные и точные доклинические модели, представляющие сложные сигнальные пути, участвующие в росте и патогенезе опухоли головного мозга, необходимы для ускорения прогресса в оценке новых терапевтических схем для ГБМ. Мышиные модели, в которых линии опухолевых клеток головного мозга человека имплантируются подкожно мышам с ослабленным иммунитетом, не отражают нативную иммунную среду опухолей головного мозга и не могут быть использованы для оценки способности терапевтических средств пересекать гематоэнцефалический барьер2. В идеале доклинические мышиные модели должны также точно воспроизводить гистопатологию GBM человека, включая высокий уровень инвазивности в окружающей паренхиме3. Хотя генетически модифицированные модели мышей (GEM) развивают опухоли в контексте интактной иммунной системы, часто требуются сложные схемы разведения, и опухоли могут развиваться медленно и непоследовательно4. Модели аллотрансплантатов, полученные из GEM, лучше подходят для доклинических терапевтических исследований, где требуются большие когорты мышей с опухолями в более короткие сроки.
В предыдущем отчете мы описали ортотопическую модель мыши GBM, полученную непосредственно из опухолей GEM. Онкогенез в GEM инициируется генетическими событиями в клеточных популяциях (в первую очередь астроцитах), экспрессирующих глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP), которые приводят к прогрессированию до GBM. Эти TRP GEM содержат трансген TgGZT121 (T), который экспрессирует T121 после воздействия рекомбиназы Cre, управляемой GFAP. Экспрессия белка T121 приводит к подавлению активности белка Rb (Rb1, p107 и p103). Совместная экспрессия трансгена Cre, управляемого GFAP (GFAP-CreERT2), нацелена на экспрессию во взрослые астроциты после индукции тамоксифеном. Мыши TRP также являются носителями Cre-зависимого мутанта Kras (KrasG12D; R) аллель, представляющий собой активацию рецепторного тирозинкиназного пути, и гетерозиготны по потере Pten (P) 5,6. Одновременные аберрации генов в цепях рецепторной тирозинкиназы (RTK), PI3K и RB участвуют в 74% патогенеза GBM7. Таким образом, первичные сигнальные пути, измененные в GBM человека, представлены сконструированными мутациями у мышей TRP, в частности опухолями GBM, в которых активируются общие последующие мишени RTK5.
Сингенная ортотопическая модель, полученная из GEM, была проверена как модель, которая повторяет особенности опухолей головного мозга человека, включая инвазивность и наличие биомаркеров подтипа, для использования в качестве платформы для оценки терапии рака, нацеленной на аберрантные пути в GBM. Клетки культивировали из опухолей, собранных из мозга TRP, и повторно имплантировали в мозг мышей, соответствующих штамму, с использованием стереотаксического оборудования для внутричерепной инъекции в кору. В этой доклинической ортотопической мышиной модели были разработаны опухоли GBM, которые были высококлеточными, инвазивными, плеоморфными с высокой частотой митоза и демонстрировали линейные очаги некроза опухолевыми клетками и плотной васкуляризацией, как это наблюдалось для GBM человека. Объемы и рост опухоли измеряли с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ) in vivo .
В этом отчете мы описываем оптимальную технику внутричерепной инъекции первичных клеток GBM или клеточных линий в мозг мыши дикого типа, используя опухоли TRP в качестве примера. Тот же протокол может быть адаптирован для мышей с ослабленным иммунитетом и других клеточных линий GBM. Даны важные советы, позволяющие избежать распространенных ошибок, таких как неоптимальная подготовка клеток или утечка клеток в месте инъекции, а также правильное использование стереотаксического оборудования для обеспечения воспроизводимости и надежности модели. В трансляционных целях мы валидируем модель с помощью МРТ-обнаружения роста опухоли головного мозга у живых животных, гистологической характеристики и представляем пример лечения у мышей с опухолями.
Доклинические модели необходимы для оценки новых терапевтических мишеней и новых стратегий лечения при ГБМ. Генетически модифицированные мышиные модели для GBM имеют преимущество возникновения опухоли в автохтонном участке, но часто с длительной латентностью и непредсказуемым росто?…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарны г-ну Алану Э. Кулаге за прекрасную техническую помощь и г-же Мишель Л. Гумпрехт за совершенствование хирургических методов. Мы благодарим доктора Филипа Л. Мартина за анализ патологии, а также г-жу Лилию Илеву и доктора Джозефа Калена из Программы визуализации мелких животных Национальной лаборатории Фредерика за МРТ-сканирование.
Этот проект был полностью или частично профинансирован за счет федеральных средств Национального института рака, Национальных институтов здравоохранения по контракту No HHSN261201500003I. Содержание этой публикации не обязательно отражает взгляды или политику Министерства здравоохранения и социальных служб, а упоминание торговых наименований, коммерческих продуктов или организаций не подразумевает одобрения со стороны правительства США.
5% methylcellulose in 1X PBS, autoclaved | Millipore Sigma | M7027 | |
1mL Tuberculin Syringe, slip tip | BD | 309659 | |
6" Cotton Tipped Applicators | Puritan | S-18991 | |
Adjustable stage platform | David Kopf Instruments | Model 901 | |
Aerosol Barrier Tips | Fisher Scientific | 02-707-33 | |
Alcohol Prep Pads Sterile, Large – 2.5 x 3 Inch | PDI | C69900 | |
B6D2 mouse strain (C57Bl/6J x DBA/2J) | Jackson Laboratory | Jax #10006 | |
Bone Wax | Surgical Specialties | 901 | |
Bupivacaine 0.25% | Henry Schein | 6023287 | |
BuprenorphineSR | ZooPharm | n/a | |
Clear Vinyl Tubing 1/8ID X 3/16OD | UDP | T10004001 | |
CVS Lubricant Eye Ointment | CVS Pharmacy | 247881 | |
Disposable Scalpels, #10 blade | Scalpel Miltex | 16-63810 | |
Gas anesthesia machine with oxygen hook-up and anesthesia box | Somni Scientific | n/a | Investigator may use facility standard equipment |
Gas anesthesia platform for mice | David Kopf Instruments | Model 923-B | |
GraphPad Prism | Graphpad | Prism 9 version 9.4.1 | |
Hamilton 30 g needle, ½ “, small hub, point pst 3 | Hamilton | Special Order | |
Hamilton precision microliter syringe, 1701 RN, no needle 10 µL | Hamilton | 7653-01 | |
Hot bead sterilizer with beads | Fine Science Tools | 18000-45 | |
Invitrogen Countess 3 Automated Cell Counter | Fisher Scientific | AMQAX2000 | |
IsoFlurane | Piramal Critical Care | 29404 | |
Isopropyl Alcohol Prep Pads | PDI | C69900 | |
ITK_SNAP (Version 36.X, 2011-present) | Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at the University of Utah | ||
KOPF Small Animal Stereotaxic Instrument with digital readout console | David Kopf Instruments | Model 940 | |
Masterflex Fitting, PVDF, Straight, Hose Barb Reducer, 1/4" ID x 1/8" ID | Masterflex | HV-30616-16 | |
Mouse Heating Plate | David Kopf Instruments | PH HP-4M | |
Mouse Rectal Probe | David Kopf Instruments | PH RET-3-ISO | |
Nalgene Super Versi-Dry Surface Protectors | ThermoFisher Scientific | 74000-00 | |
P20 pipette | Gilson | F123600 | |
Povidone Iodine Surgical Scrub | Dynarex | 1415 | |
Reflex 9 mm Wound Clip Applicator | Fine Science Tools | 12031-09 | |
Reflex 9 mm Wound Clip Remover | Fine Science Tools | 12033-00 | |
Reflex 9 mm Wound Clips | Fine Science Tools | 12032-09 | |
Semken forceps, curved | Fine Science Tools | 11009-13 | |
Temperature Controller | David Kopf Instruments | PH TCAT-2LV | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
Tuberculin Syringe with 25g needle, slip tip | BD | 309626 | |
UltraMicroPump 3 with Micro2T Controller | World Precision Instruments | Model UMP3T |