Translationella ortotopiska modeller av Glioblastoma multiforme
Summary
Här beskriver vi en preklinisk ortotopisk musmodell för GBM, etablerad genom intrakraniell injektion av celler härledda från genetiskt modifierade musmodelltumörer. Denna modell visar sjukdomskännetecknen för mänsklig GBM. För translationella studier spåras hjärntumören hos möss genom in vivo MR och histopatologi.
Abstract
Genetiskt modifierade musmodeller (GEM) för human glioblastoma multiforme (GBM) är avgörande för att förstå utvecklingen och progressionen av hjärntumörer. Till skillnad från xenografttumörer, i GEMs, uppstår tumörer i den ursprungliga mikromiljön i en immunkompetent mus. Användningen av GBM GEMs i prekliniska behandlingsstudier är dock utmanande på grund av långa tumörlatenser, heterogenitet i neoplasmfrekvens och tidpunkten för tumörutveckling av avancerad kvalitet. Möss inducerade via intrakraniell ortotopisk injektion är mer lätthanterliga för prekliniska studier och behåller funktionerna hos GEM-tumörerna. Vi genererade en ortotopisk hjärntumörmodell härledd från en GEM-modell med Rb-, Kras- och p53-avvikelser (TRP), som utvecklar GBM-tumörer som visar linjära foci av nekros av neoplastiska celler och tät vaskularisering analog med human GBM. Celler härledda från GEM GBM-tumörer injiceras intrakraniellt i vildtyp, stammatchade mottagarmöss och reproducerar grad IV-tumörer, vilket kringgår den långa tumörlatensperioden hos GEM-möss och möjliggör skapandet av stora och reproducerbara kohorter för prekliniska studier. De mycket proliferativa, invasiva och vaskulära egenskaperna hos TRP GEM-modellen för GBM rekapituleras i de ortotopiska tumörerna, och histopatologimarkörer återspeglar humana GBM-undergrupper. Tumörtillväxt övervakas av seriella MR-skanningar. På grund av den invasiva karaktären hos de intrakraniella tumörerna i immunkompetenta modeller är det viktigt att noggrant följa injektionsproceduren som beskrivs här för att förhindra extrakraniell tumörtillväxt.
Introduction
Glioblastom (GBM; grad IV gliom) är den vanligaste och maligna hjärntumören, och nuvarande behandlingar är ineffektiva, vilket resulterar i en medianöverlevnad på 15 månader1. Tillförlitliga och exakta prekliniska modeller som representerar de komplexa signalvägar som är involverade i hjärntumörtillväxt och patogenes är avgörande för att påskynda framstegen i utvärderingen av nya terapeutiska regimer för GBM. Musmodeller där humana hjärntumörcellinjer implanteras subkutant i immunsupprimerade möss återspeglar inte den naturliga immunmiljön hos hjärntumörer, och de kan inte heller användas för att utvärdera terapins förmåga att passera blod-hjärnbarriären2. Helst bör prekliniska musmodeller också nära reproducera den humana GBM-histopatologin, inklusive den höga invasiviteten i det omgivande parenkymet3. Även om genetiskt modifierade musmodeller (GEM) utvecklar tumörer i samband med ett intakt immunförsvar, krävs ofta komplicerade avelssystem och tumörer kan utvecklas långsamt och inkonsekvent4. GEM-härledda allograftmodeller är bättre lämpade för prekliniska terapeutiska studier, där stora kohorter av tumörbärande möss behövs inom en kortare tidsram.
I en tidigare rapport beskrev vi en ortotopisk GBM-musmodell härledd direkt från GEM-tumörer. Tumörgenes i GEM initieras av genetiska händelser i cellpopulationer (främst astrocyter) som uttrycker gliafibrillärt surt protein (GFAP), vilket resulterar i progression till GBM. Dessa TRP GEMs har en TgGZT121-transgen (T), som uttrycker T121 efter exponering för GFAP-driven Cre-rekombinas. T121-proteinuttryck resulterar i undertryckande av Rb (Rb1, p107 och p103) proteinaktivitet. Samuttryck av en GFAP-driven Cre-transgen (GFAP-CreERT2) riktar sig mot uttryck till vuxna astrocyter efter induktion med tamoxifen. TRP-möss har också en Cre-beroende mutant Kras (KrasG12D; R) allel, för att representera aktivering av receptortyrosinkinasvägen, och är heterozygota för förlust av Pten (P)5,6. Samtidiga genavvikelser i receptortyrosinkinas (RTK), PI3K och RB-nätverk är inblandade i 74% av GBM-patogenes7. Därför representeras de primära signalvägarna som förändras i human GBM av de konstruerade mutationerna i TRP-möss, i synnerhet GBM-tumörer, där delade nedströmsmål för RTK aktiveras5.
Den GEM-härledda syngena ortotopiska modellen validerades som en modell som rekapitulerar egenskaper hos mänskliga hjärntumörer, inklusive invasivitet och förekomst av subtypbiomarkörer, för användning som en plattform för att utvärdera cancerterapier riktade mot avvikande vägar i GBM. Celler odlades från tumörer skördade från TRP-hjärnor och implanterades i hjärnan hos stammatchade möss, med hjälp av stereotaktisk utrustning för intrakraniell injektion i cortex. Denna prekliniska ortotopiska musmodell utvecklade GBM-tumörer som var mycket cellulära, invasiva, pleomorfa med hög mitotisk hastighet och visade linjära foci av nekros av neoplastiska celler och tät vaskularisering, som observerats för human GBM. Tumörvolymer och tillväxt mättes med magnetisk resonanstomografi in vivo (MRT).
I denna rapport beskriver vi den optimala tekniken för intrakraniell injektion av primära GBM-celler eller cellinjer i vildtypsmushjärnan, med TRP-tumörer som exempel. Samma protokoll kan anpassas för immunsupprimerade möss och andra GBM-cellinjer. Viktiga tips ges för att undvika vanliga fallgropar, såsom suboptimal cellpreparering eller cellläckage vid injektionsstället, och för att använda stereotaktisk utrustning korrekt för att säkerställa modellens reproducerbarhet och tillförlitlighet. För translationella ändamål validerar vi modellen genom MR-detektion av hjärntumörtillväxt hos levande djur, histologisk karakterisering och presenterar ett exempel på behandling i tumörbärande möss.
Protocol
Representative Results
Discussion
Prekliniska modeller är avgörande för utvärdering av nya terapeutiska mål och nya behandlingsstrategier inom GBM. Genetiskt modifierade musmodeller för GBM har fördelen av tumörförekomst i det inhemska stället, men ofta med lång latens och oförutsägbar tumörtillväxt13. GEM-modellens tumörer uppvisar en latens på 4-5 månader, och det ideala tidsfönstret för avbildning, rekrytering och behandling varierar mellan enskilda möss. Den ortotopiska modellen har en väletablerad och l?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma mot Alan E. Kulaga för utmärkt teknisk hjälp och mot Michelle L. Gumprecht för att ha förfinat de kirurgiska teknikerna. Vi tackar Dr. Philip L. Martin för patologianalys och Lilia Ileva och Dr. Joseph Kalen från Frederick National Laboratory Small Animal Imaging Program för MR-skanningar.
Detta projekt har finansierats helt eller delvis med federala medel från National Cancer Institute, National Institutes of Health, enligt kontrakt nr. HHSN261201500003I. Innehållet i denna publikation återspeglar inte nödvändigtvis åsikter eller policyer från Department of Health and Human Services, och omnämnandet av handelsnamn, kommersiella produkter eller organisationer innebär inte heller godkännande av den amerikanska regeringen.
Materials
| 5% methylcellulose in 1X PBS, autoclaved | Millipore Sigma | M7027 | |
| 1mL Tuberculin Syringe, slip tip | BD | 309659 | |
| 6" Cotton Tipped Applicators | Puritan | S-18991 | |
| Adjustable stage platform | David Kopf Instruments | Model 901 | |
| Aerosol Barrier Tips | Fisher Scientific | 02-707-33 | |
| Alcohol Prep Pads Sterile, Large – 2.5 x 3 Inch | PDI | C69900 | |
| B6D2 mouse strain (C57Bl/6J x DBA/2J) | Jackson Laboratory | Jax #10006 | |
| Bone Wax | Surgical Specialties | 901 | |
| Bupivacaine 0.25% | Henry Schein | 6023287 | |
| BuprenorphineSR | ZooPharm | n/a | |
| Clear Vinyl Tubing 1/8ID X 3/16OD | UDP | T10004001 | |
| CVS Lubricant Eye Ointment | CVS Pharmacy | 247881 | |
| Disposable Scalpels, #10 blade | Scalpel Miltex | 16-63810 | |
| Gas anesthesia machine with oxygen hook-up and anesthesia box | Somni Scientific | n/a | Investigator may use facility standard equipment |
| Gas anesthesia platform for mice | David Kopf Instruments | Model 923-B | |
| GraphPad Prism | Graphpad | Prism 9 version 9.4.1 | |
| Hamilton 30 g needle, ½ “, small hub, point pst 3 | Hamilton | Special Order | |
| Hamilton precision microliter syringe, 1701 RN, no needle 10 µL | Hamilton | 7653-01 | |
| Hot bead sterilizer with beads | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Invitrogen Countess 3 Automated Cell Counter | Fisher Scientific | AMQAX2000 | |
| IsoFlurane | Piramal Critical Care | 29404 | |
| Isopropyl Alcohol Prep Pads | PDI | C69900 | |
| ITK_SNAP (Version 36.X, 2011-present) | Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at the University of Utah | ||
| KOPF Small Animal Stereotaxic Instrument with digital readout console | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Masterflex Fitting, PVDF, Straight, Hose Barb Reducer, 1/4" ID x 1/8" ID | Masterflex | HV-30616-16 | |
| Mouse Heating Plate | David Kopf Instruments | PH HP-4M | |
| Mouse Rectal Probe | David Kopf Instruments | PH RET-3-ISO | |
| Nalgene Super Versi-Dry Surface Protectors | ThermoFisher Scientific | 74000-00 | |
| P20 pipette | Gilson | F123600 | |
| Povidone Iodine Surgical Scrub | Dynarex | 1415 | |
| Reflex 9 mm Wound Clip Applicator | Fine Science Tools | 12031-09 | |
| Reflex 9 mm Wound Clip Remover | Fine Science Tools | 12033-00 | |
| Reflex 9 mm Wound Clips | Fine Science Tools | 12032-09 | |
| Semken forceps, curved | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Temperature Controller | David Kopf Instruments | PH TCAT-2LV | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Tuberculin Syringe with 25g needle, slip tip | BD | 309626 | |
| UltraMicroPump 3 with Micro2T Controller | World Precision Instruments | Model UMP3T |
Referências
- Tamimi, A. F., Juweid, M. Epidemiology and Outcome of Glioblastoma. Glioblastoma. , (2017).
- Robertson, F. L., Marques-Torrejon, M. A., Morrison, G. M., Pollard, S. M. Experimental models and tools to tackle glioblastoma. Disease Models & Mechanisms. 12 (9), (2019).
- Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults. The New England Journal of Medicine. 359 (5), 492-507 (2008).
- Haddad, A. F., et al. Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies. Neuro-Oncology Advances. 3 (1), (2021).
- El Meskini, R., et al. A preclinical orthotopic model for glioblastoma recapitulates key features of human tumors and demonstrates sensitivity to a combination of MEK and PI3K pathway inhibitors. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 45-56 (2015).
- Song, Y., et al. Evolutionary etiology of high-grade astrocytomas. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (44), 17933-17938 (2013).
- Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 455 (7216), 1061-1068 (2008).
- Motomura, K., et al. Immunohistochemical analysis-based proteomic subclassification of newly diagnosed glioblastomas. Cancer Science. 103 (10), 1871-1879 (2012).
- Choyke, P. L., Dwyer, A. J., Knopp, M. V. Functional tumor imaging with dynamic contrast-enhanced magnetic resonance imaging. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 17 (5), 509-520 (2003).
- Raza, S. M., et al. Identification of necrosis-associated genes in glioblastoma by cDNA microarray analysis. Clinical Cancer Research. 10, 212-221 (2004).
- Raza, S. M., et al. Necrosis and glioblastoma: a friend or a foe? A review and a hypothesis. Neurosurgery. 51 (1), 2-12 (2002).
- Hambardzumyan, D., Bergers, G. Glioblastoma: defining tumor niches. Trends in Cancer. 1 (4), 252-265 (2015).
- Kijima, N., Kanemura, Y. Glioblastoma. Mouse Models of Glioblastoma. , (2017).
- Casanova, F., Carney, P. R., Sarntinoranont, M. Effect of needle insertion speed on tissue injury, stress, and backflow distribution for convection-enhanced delivery in the rat brain. PloS One. 9 (4), 94919 (2014).
- Jin, F., Jin-Lee, H. J., Johnson, A. J. Mouse Models of Experimental Glioblastoma. Gliomas. , (2021).
- Zalles, M., Towner, R. A. Pre-Clinical Models and Potential Novel Therapies for Glioblastomas. Gliomas. , 1-13 (2021).
- Wierzbicki, K., et al. Targeting and therapeutic monitoring of H3K27M-mutant glioma. Current Oncology Reports. 22 (2), 19 (2020).
